① 提取動物的細胞膜,以成熟紅細胞做材料,先在清水中吸水脹破,再經過____處理即可得到純凈的細胞膜
1、離心
2、一定的流動性
② 制備細胞膜的方法
首先是制備一定量的細胞,細胞的來源可以是培養細胞,也可以是某種組織。培養細胞的收集相對簡單一些,直接用胰酶將細胞從培養瓶上消化下來,製成細胞懸浮液。比較易碎的組織細胞的收集如肝、脾等,可採用勻漿的方法,稍加研磨就可製成細胞懸液。有些結締組織,直接研磨不易分離出細胞,可先用適量的膠原酶處理。
細胞制備出來後,進行勻漿處理。勻漿的方法有多種,如用高速打碎機破碎,低滲,玻璃珠與細胞共振盪,凍融法,超聲波打碎等。可根據實驗需要和實驗室條件來選擇。無論選擇哪種方法,都要盡可能保持膜的完整性。整個操作過程要避免過於激烈,pH、離子強度和滲透壓等條件要適中,一般常用中性和等滲溶液。
勻漿產生的細胞裂解物,可通過一系列差速離心再加上一個梯度離心來分離細胞膜與細胞器,梯度是根據細胞器的大小、密度和沉降特性來設計的。勻漿分步分離的第一步是差速離心,在一系列的離心過程中離心力逐漸加大,並且將細胞器加入到具有密度梯度的介質中離心,常用的分離介質有蔗糖、甘油、葡聚糖等。由於每種細胞器的大小和沉降特性不同,因此可被分離出來。如果只是分離細胞中的某種細胞器,可直接根據那種細胞器所對應的相對離心力,在細胞勻漿後進行離心分離。哺乳動物紅細胞的結構比較簡單,其細胞膜可用低滲離心的方法分離出來。如果是獨特的細胞膜,可根據表面電荷的密度採用電泳的方法分離,也可根據大小採用凝膠過濾的方法分離
③ 獲取細胞膜的方法和原理
細胞膜由脂類(主要是磷脂和膽固醇)、蛋白質、和少量糖類組成。想破壞細胞膜有化學方法和物理方法。物理方法主要是藉助外力或者射線一類物理因子破壞細胞膜結構(例如低濃度脹破射線破壞蛋白質構象等);化學方法較多主要分酶解法和酸鹼破壞,另外還有一些致毒有機物也可以。
④ 請問知不知道怎麼提取動物細胞的亞細胞器,比如內質網、高爾基體、線粒體、細胞膜啊這些,具體怎麼操作
用離心法,通過不同速率(v從小到大)來提取質量不同的各細胞器(上清液與沉澱)
⑤ 如何提取細胞膜(動物細胞)上的蛋白質
一,蛋白質(包括酶)的提取
大部分蛋白質都可溶於水、稀鹽、稀酸或鹼溶液,少數與脂類結合的蛋白質則溶於乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中,因些,可採用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。
(一)水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面,多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利於溶解,縮短提取時間。但另一方面,溫度升高會使蛋白質變性失活,因此,基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫(5度以下)操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑(如二異丙基氟磷酸,碘乙酸等)。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
蛋白質,酶是具有等電點的兩性電解質,提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 范圍內。用稀酸或稀鹼提取時,應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化,從而導致蛋白質構象的不可逆變化,一般來說,鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液。
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶,稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合,具有保護蛋白質不易變性的優點,因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。
(二)有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶,不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑,它們具的一定的親水性,還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越,一是因為丁醇親脂性強,特別是溶解磷脂的能力強;二是丁醇兼具親水性,在溶解度范圍內(度為10%,40度為6.6%)不會引起酶的變性失活。另外,丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣,也適用於動植物及微生物材料。
二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多,主要有:
(一)根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質的溶解度增加,此稱鹽溶;當鹽濃度繼續升高時,蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出,這種現象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質分子的水化層,使之「失水」,於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有:
(1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低,更容易鹽析。
(2)pH值:大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。
(3)蛋白質濃度:蛋白質濃度高時,欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來(共沉現象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨,它的優點是溫度系數小而溶解度大(25度時飽和溶液為4.1M,即767克/升;0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升),在這一溶解度范圍內,許多蛋白質和酶都可以鹽析出來;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當用其他pH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後,需要將蛋白質中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質溶液裝入秀析袋內(常用的是玻璃紙),用緩沖液進行透析,並不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質的等電點有差別,可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質溶解度降低並析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質較易變性,應在低溫下進行。
(二)根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質分子通過半透膜,而蛋白質留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。
(三)根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同,可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下,因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質作為載體,電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素),當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上,隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。(詳見層析技術章)
(四)根據配體特異性的分離方法-親和色譜法
親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質的一種極為有效的方法,它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價地結合。其基本原理:蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質,因此蛋白質的分離(Separation),提純(Purification)
和鑒定(Characterization)是生物化學中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來,因此往往採取幾種方法聯合使用。
⑥ 幫忙告訴我一種獲得細胞膜(動物細胞)的實驗方法吧~
暈,用其他細胞提取的細胞膜不純。
如果你硬要用其他細胞提取,用清水就可以勒,象提取紅細胞的那樣,不過最後結果就是細胞膜和其他細胞器膜混合在一起
⑦ 怎麼提取細胞膜細胞膜吸水漲破後細胞膜不就破了嗎
將哺乳動物的紅細胞倒入水中
讓細胞吸水脹破
然後離心
取上層清液過濾
就能得到細胞膜。
紅細胞吸水脹破後,裡面的水溶性血紅蛋白會進入水中,而剩下的細胞膜由於磷脂的疏水性和流動性會自動封閉形成一個空殼(生物學專業術語稱之為「血影」),所以很容易與其它成分分開。因此,紅細胞膜也是研究生物膜功能的良好材料。
⑧ 若想提取動物細胞的細胞膜最好選用答案
若想提取動物細胞的細胞膜最好選用哺乳動物的紅細胞。
教材第41頁上有這個知識點。
⑨ 如何提取細胞膜
具體步驟:
1、倒入水中,讓細胞吸水脹破
2、然後離心,取上層清液過濾,就能得到細胞膜
哺乳動物成熟的紅細胞內只有血紅蛋白,無核無細胞器,細胞膜主要成分是磷脂,質量分數比蛋白質小,離心後會分層,細胞膜處於上層清液中。雞鴨血中的細胞器也會脹破,離心後同樣能分離。