① 人和小白鼠都是哺乳動物，胰高血糖素對小白鼠和人具有相同的生理作用．為了驗證胰高血糖素具有升高血糖
二、方法步驟第一步，實驗設計要遵循對照原則和單一變數原則，所以該實驗要求設計兩組實驗，一組小白鼠為實驗鼠，腹腔注射胰高血糖素溶液；另一組小白鼠為對照鼠，腹腔注射等量的生理鹽水．三、實驗結果的預測、分析和結論 （1）1試管內出現磚紅色沉澱，說明實驗鼠尿液中含有葡萄糖；2試管內溶液仍為藍色（斐林試劑的顏...色），說明對照鼠尿液中無葡萄糖． （2）實驗結論：實驗鼠血糖升高，超過一定數值後會出現糖尿，這是由於胰高血糖素具有升高血糖的生理作用．故答案為：二、方法步驟第一步，胰高血糖素溶液; ;; 等量的生理鹽水三、實驗結果的預測、分析和結論（1）1試管內出現磚紅色沉澱，說明實驗鼠尿液中含有葡萄糖；2試管內溶液仍為藍色，說明對照鼠尿液中無葡萄糖（註：試管內的尿液來源要與顏色反應相對應）（2）實驗鼠血糖含量升高，超過一定數值而出現糖尿，這是由於胰高血糖素具有升高血糖含量的生理作用所引起的
② 酶作為生物催化劑，不僅具有一般無機催化劑的特點，還具有專一性、高效性和溫和性等特點，請用所給的實驗
（1）該題是要驗證蔗糖酶和澱粉酶的催化作用具有專一性，通過實驗目的和實驗材料分析出實驗是自變數是底物不同、酶種類不同，因變數是否出現磚紅色沉澱，其他屬於無關變數，實驗的分組應分四組，實驗設計應遵循對照性原則、科學性原則和單一變數原則．
因此表格中所填內容如下；
| 溶液 試管 | 蔗糖溶液 | 澱粉溶液 | 蔗糖酶溶液 | 唾液澱粉酶溶液 |
| 甲 | + | - | + | - |
| 乙 | + | - | - | + |
| 丙 | - | + | + | - |
| 丁 | - | + | - | + |
| 溶液 試管 | 蔗糖溶液 | 澱粉溶液 | 蔗糖酶溶液 | 唾液澱粉酶溶液 |
| 甲 | + | - | + | - |
| 乙 | + | - | - | + |
| 丙 | - | + | + | - |
| 丁 | - | + | - | + |
③ 毒理學試驗方法有哪些
現代毒理學的研究方法，由於其本身包括眾多的分支學科，分別在相應的學科領域里建立了自己的研究方法，現歸納為兩大類。(一)實驗研究(微觀研究)動物實驗的方法仍是現代毒理學實驗的重要方法之一，傳統的毒理學通過整體動物實驗已為人類提供了大量的以劑量-效應(反應)為主的資料庫，結合人群接觸水平對許多化學物質進行了安全性(危險度)評價。
由於外源物的數量巨大，整體動物實驗需要消耗大量的時間和經費，也不能滿足數以萬計的外源化學物質的毒性評價要求，另一方面為了保護動物，盡量減少動物的使用，所以由過去以整體動物試驗佔主導地位的觀念，轉向以體外試驗為主導地位的趨勢。但也需指出，體外試驗的發展並不排斥整體實驗的重要性，兩者相互補充，互為驗證才能為科學研究提供可靠數據，隨著生命科學的發展，分子生物學的理論及技術被引入現代毒理學，近年來在分子水平上建立了許多新方法。
1．體內試驗
哺乳動物體內試驗，也稱整體動物實驗，一般包括：急性毒性試驗、亞急性毒性試驗、亞慢性毒性試驗及慢性毒性試驗。還有特殊毒性實驗，如哺乳動物致突變試驗、致畸試驗、致癌試驗。以上試驗在毒理學中統稱「三性」和「三致」試驗。
常用的試驗動物：大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、家兔、狗、猴等。檢測環境污染物的毒性試驗，常選用魚、蚤類或其他水生生物。還可用鳥類、昆蟲進行試驗。
近年來為了從分子水平探討致突、致癌機制，轉基因動物已開始在毒理學試驗中應用。
轉基因動物是一種集整體水平、細胞水平和分子水平於一體的實驗動物，更能體現生命整體研究的效果，它是把經典的與現代的毒理學研究方法相結合，無疑會推動現代毒理學實驗研究的發展。
2．體外試驗
利用游離器官、培養的細胞、細胞器以及利用微生物等進行毒性研究的方法為體外試驗，此方法多用於觀察外源物對生物體特殊毒性的初步篩檢及作用機制和代謝轉化過程的深入研究。
體內與體外試驗各有優點和局限性，應根據試驗目的和要求，選擇一組試驗，才能互相彌補優缺點。(二)人群調查(宏觀研究)人群調查也稱為人群毒理學，是在人群中研究外源物對人體產生毒作用的規律，為人群檢測和制訂預防措施提供比動物試驗更直接更可靠的毒理學資料，主要包括以下3個方面：
1．中毒臨床觀察
常見於偶然發生的事故，如誤服、自殺、毒性災害等，通過急性中毒事故的處理和治療，可直接觀察到中毒的症狀並分析可能的毒效應的靶器官。
2．志願者試驗
在不損害人體健康的原則下，有時可設計一些不損害人體健康的受控試驗，僅限於低劑量、短時期的接觸毒性作用可逆的化學品，目前國際上提倡健康志願者的毒性試驗，減少由動物試驗結果外推於入的不確定性，特別是一些神經毒物出現的毒性效應，如頭暈、目眩、復視等需要表達的中毒症狀，只有人才能真實地反映出來，所以國外健康志願者的毒理學研究資料倍受重視。
3．流行病學調查
將動物試驗的結果，進一步在人群調查中驗證，可以從人群的直接觀察中，取得動物試驗所不能獲得的資料，優點是接觸條件真實，觀察對象是一個大的群體，為人群檢測和防治措施提供比動物試驗更直接、更可靠的科學資料，但是也存在許多難點：①人群中觀察外源物的毒性效應大多數為慢性毒性效應，特別是人類致癌物質其致癌效應所需時間過長；②接觸人群中所用的觀察指標是非特異性的，與對照人群比較需要足夠例數：③外環境因素混雜，外源物的種類繁多而且多種化學物質可出現聯合作用，難以確定某種特定的化學物質毒性效應和其因果關系。
近年來由於分子生物學的發展和滲透，在傳統流行病學調查方法中引進了細胞、分子水平的人群檢測方法，如生物標志物作為癌症早期判斷的信息，把分子生物學與流行病學結合為一體發展為分子流行病學。這門新興學科利用分子生物學、分子遺傳學、生物化學、免疫學等手段研究，評價不同人群或個體致癌危險度及其機制，從而使現代毒理學由實驗動物研究發展到人群和個體易感性研究的新階段。
它可以解答人體從接觸化學物質到發生疾病的過程中所發生的一系列連續性的變化，從中提取更多的癌前病變的信息，為癌症的早期判斷、早期防治提供科學依據。可以預測，分子流行病學在21世紀將會得到更大的發展。
綜上所述，正確的方法是將宏觀研究與微觀研究有機地結合起來，宏觀研究為微觀研究提供線索，微觀研究為宏觀研究提供依據，兩者結合起來才能對外源化學物質作出准確的危險度評價。
④ 哺乳動物細胞蛋白表達純化服務實驗報告案例
本案例基於pAZV5分泌表達體系，使用基因合成的方法構建pAZV5表達載體，瞬時轉染HEK293懸浮細胞，通過SDS-PAGE和 Western Blot檢測蛋白的表達情況，擴大培養收集細胞上清並通過Ni柱的親和純化獲得目的蛋白。
一、實驗設計
我們分析客戶提供的Target-Gene序列，整個蛋白序列呈親水性，自身不帶信號肽序列，因此我們設計思路為：
1.1、以客戶的基因序列翻譯的蛋白序列為源模板，通過密碼子優化一套最適宜HEK293細胞系的基因序列。
1.2、推薦客戶使用鍾鼎生物的自主載體pAZ-V5載體來進行實驗，利用載體自帶的V5信號肽序列幫助蛋白穿膜分泌表達至胞外，為了保持蛋白的N端活性，我們在C端添加6XHis-Tag便於重組蛋白的檢測和親和純化。
依據上述設計思路，以基因合成的方式構建pAZ-V5表達質粒，經過測序和酶切驗證無誤後，挑取無內毒素的質粒。轉染200ml HEK293細胞，通過western blot檢測蛋白表達情況，確認蛋白表達情況，再通過Ni-resin親和純化獲得80%以上目的蛋白。
二、試劑和耗材
名稱 公司 名稱 公司
DMEM 高糖、DMEM低糖、胎牛血清、胰蛋白酶、opti SFM、轉染試劑Invitrogen（Gibco）無內毒素質粒中提試劑盒、LAL內毒素檢測試劑、基礎化學試劑、低熔點瓊脂糖Sigma公司
抽提試劑盒Axygen公司PCR試劑盒IO-RAD公司
六孔板、細胞培養瓶、離心管corning公司PCR反應管Fisher公司
DNA膠純化試劑盒、質粒小提試劑盒AXYGEN公司Agarose上海基因公司
中性紅碧雲天生物公司其它試劑均為國產分析純
二、主要實驗儀器
儀器名稱 公司 儀器名稱 公司 儀器名稱 公司
Allegra 21R 台式高速冷凍離心機美國BECKMAN公司台式高速離心機德國SORVAL公司Mini Protean II垂直平板電泳系統、Gel Doc2000成像系統、水平電泳系統美國BIO-RAD公司
PTC-200基因擴增儀美國MJ Research公司320-S pH計美國Mettler Toledo公司AR5120電子天平美國AHOM S公司
MultiTemp III 恆溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀美國Amersham Pharmacia公司雪花狀製冰機日本SANYO公司JY92-2D超聲波細胞粉碎機中國新芝科器研究所
蛋白核酸檢測儀南京大學普陽科學儀器廠NANODROP2000美國Thermo公司超凈工作台中國蘇凈集團
四、蛋白性質分析
4.1 客戶提供原始基因序列
GTGGGGTGCT******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客戶研究內容，不予顯示----NNNNNNNNNNNNNNN*******CTTCTCCCTT
4.2 編碼的蛋白序列如下（理論分子量41.18KD，理論等電點PI6.73）
GCSVDFSK******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客戶研究內容，不予顯示----NNNNNNNNNNNNNNN*******TAGSTDHMDHFSL
4.3 稀有密碼子序列分析如下圖所示（紅色：使用頻率低於10% 灰色：使用頻率低於20%，綠色為正常頻率密碼子）
4.4 蛋白序列跨膜及親疏水性分析
4.5 信號肽預測
綜上所述：
1、蛋白理論分子量為 41KD，屬於正常分子量范圍，較適宜表達。
2、通過對基因密碼子使用頻率的分析，如果以293細胞為表達宿主，基因序列上使用頻率低於20%的密碼子X個，使用頻率低於10%的密碼子X個，優化後通過基因合成方式獲得目的基因。
3、通過對蛋白的跨膜結構和親疏水性分析，蛋白整體呈親水性，但從473AA之後，蛋白存在典型的跨膜結構，建議去除後表達以提高成功率。
4、目的蛋白自身無信號肽，添加GP67信號肽便於蛋白分泌表達。為了純化方便，考慮在C端添加His標簽。
五、實驗方法及實驗結果
5.1 pAZ-V5表達質粒構建
採用基於PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因，雙酶切連接至pAZ-V5載體的Afl II和Xba I之間；將獲得的重組質粒轉入TOP10克隆菌株，挑取陽性克隆子測序，測序結果拼接如下所示，單劃線區為目的基因基因區域。紫色區域為酶切位點，黃色區域為v5信號肽，綠色區域為6XHis標簽；
T A G C A G A G C T C T C T G G C T A C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C T G G C T T A T C G A A A T T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G A G A C C C A A G C T G G C T A G C G T T T A A A C T T A A G C * * X 3 * * * * N N N N N N---略-----N N N N N N * * T G A G T A G G C A C C A C C A C C A C C A C C A C T G A C T C T A G A G G
5.2 使用Chromas軟體查看測序峰圖文件，截取部分序列示例如下：
5.3 pAZ-V5載體圖如下所示：
表達條件優化
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⑤ DNA染色實驗中用哺乳動物或人的成熟紅細胞進行,會出現什麼結果
DNA染色實驗是利用DNA與甲基綠的結合性，呈現綠色，而哺乳動物或人的成熟紅細胞已高度特化，沒有細胞核和細胞器，也就沒有DNA，所以不會呈現綠色。
⑥ 如何驗證一段在哺乳動物不存在的序列
如何驗證一段在哺乳動物不存在的序列
有SV40病毒表達載體、痘病毒表達載體、逆轉錄病毒表達載體，常見的哺乳動物表達載體的組成成分有：原核DNA序列、啟動子、增強子、拼接 信號、終止信號和多聚腺苷酸化信號、篩選標記及真核病毒序列等。
(1)原核DNA序列： 為了能在大腸桿菌中增殖，得到大量能轉染哺乳動物細胞的重組DNA，不哺乳動物表達載體中通常有一段原核序列，包括一個能在大腸桿菌中自身復制的復制子， 便於挑選含重組DNA細菌的抗生素抗性基因，以及便於把真核序列插入載體的少數單一限制性酶切位點。當具 備這些序列以後，外源的真核基因序列可由單一酶切位點插入載體中，形成的重組DNA可在大腸桿菌中增殖，經抗生素篩選後進行DNA提取，即可得到大量的所需的哺乳動物細胞表達載體。
(2)啟動子： 真核生物的啟動子區域位於TATA區上游100bpd到230bp之間，TAT區位於轉錄起始點上游25-30bp處。啟動 子的轉錄銷路因細胞而異。因此需根據宿主細胞類型選擇不同的啟動子。
(3)增強子： 增強子是使啟動子的基因轉錄效率顯著提高的一類順式作用元件，有多個獨立核苷酸序列組成。它們的作用通常不具有方向性，在位於轉錄起始點的下游或離啟動子很遠是仍有活性。許多增強子只 能在特定的組織或細胞中起作用，即具有組織細胞的特異性，因此在構建真核表達載體的時候，應根據宿主細胞來選擇增強子。
(4)剪接信號： 真核基因由許多內含子和外顯子組成。被轉錄成mRNA前體以後，需通過剪除內含子、連接外顯子才能成為成熟的mRNA。一 般mRNA拼接需要的基本序列位於內含子的5』和3』末端，因此，改變拼接位點5』和3』末端兩側的外顯子序列可能回影響鄰近拼接位點的使用效率，在替換 外顯子是應注意。
(5)終止信號和多聚腺苷化的信號： 轉錄的終止信號常常位於多聚腺苷化位點下游的一端長度為幾百個核苷酸鹼基的DNA區域內。多聚腺苷化需要兩種序列：位於腺苷化位點下游的GU豐富區或U豐富區和 位於腺苷化位點上游11-30個核苷酸處的一個有6個核苷酸鹼基組成並高度保守的AAUAAA序列。為了保證目的mRNA能有效地多聚腺苷化，真核表達載體上必須包括多聚腺苷化下游的一端序列。最常用的方法是用SV40的一端237bp長的BamHⅠ- BclI 限制性片段，含有多聚腺苷化的信號。另一種的方法是將全長 cDNA與已組裝在表達載體上一個順式作用因子的部分片段融合，提供多聚腺苷化的信號。
（6）遺傳標記： 從成千上萬個哺乳細胞中，檢測出極少數的含DNA重組體的轉染細胞，並鑒定已導入外源DNA是哺乳動物細胞基因表達系統的一個關鍵內容。因此，在真核生物 表達載體上必須附有標記基因，才能進行篩選。常用的標記基因有：胸苷激酶基因（thymidine kinase，TK）、二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolate rectase，DHFR）、氯黴素乙醯轉移酶基因（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）、新黴素抗性基因（neomycin resistance,NEO）等。
⑦ 哺乳動物實驗時需要注意哪些條件
溫度：本實驗控制恆定溫度37度 濕度：要時刻記住用相應的潤濕液潤濕,本次試驗用哺乳動物的台氏液 PH：要與哺乳動物體液相似 避免不必要的刺激：不要用手或者是金屬觸碰 離子成分與濃度：要與相關的動物體液相似,本實驗是台氏液 特殊要求:神經實驗時要准備隔離盒.
⑧ 驗證酶的專一性，實驗該怎麼做
[教師准備]：查閱資料，設計合理的實驗步驟，並對實驗結果進行分析，總結影響實驗結果的因素及其實驗過程中的注意事項。精心備課，設計合理的問題，引導學生進行探究。並且為實驗准備好材料用具酶的專一性探究實驗：一課時。 [實驗原理] 澱粉在唾液澱粉酶的催化作用下，能夠水解成麥芽糖。在煮沸的條件下，斐林試劑能使麥芽糖氧化，自身還原成磚紅色的氧化亞銅沉澱。因此，斐林試劑可以用來鑒定溶液中是否有麥芽糖，進而可以看出唾液澱粉酶是否只能催化澱粉水解，不能催化其他糖類（如蔗糖）水解。
[目的要求] 1．初步學會做酶的專一性實驗的方法。 2．理解酶具有專一性的特點。
[材料用具]
新鮮的唾液。
消過毒的脫脂棉，鑷子，試管，小燒杯，量簡，玻璃棒，酒精燈，火柴。
質量濃度為3%的可溶性澱粉溶液，質量濃度為3%的蔗糖溶液，新配置的斐林試劑，清水。
[方法步驟]
1．用清水將口漱凈，口內含一塊消過毒的脫脂棉。用鑷子取出脫脂棉，使其中的唾液收集到小燒杯中。
2．取3mL唾液，注入另一個小燒杯中，加入30mL蒸餾水，用玻璃棒攪勻，製成稀釋的唾液備用。
3． 取兩支潔凈的試管，編號1.2，按下表加入試劑：
1號試管:3%澱粉溶液 2mL 再加稀釋唾液2mL
2號試管:3%蔗糖溶液 2mL 再加稀釋唾液2mL
搖勻，37℃保溫5 min
4.向兩支試管中加新配置的斐林試劑 2mL 搖勻，100℃保溫3 min
現象: 1號試管:磚紅 2號試管: 藍色
⑨ 請用所給的實驗材料和用具，設計實驗來驗證哺乳動物的蔗糖酶和澱粉酶的催化作用具有專一性，要求完成實驗
(1) (2) ②．混勻，37℃恆溫水浴一段時間 ; ③．取出試管，分別加入適量的斐林試劑，混勻，沸水水浴一段時間; ; ④．觀察實驗現象並記錄實驗結果(3)含有蔗糖和蔗糖酶溶液的試管，以及含澱粉和澱粉酶溶液的試管中出現磚紅色沉澱，其他試管中不出現磚紅色沉澱(4)酶的催化作用有專一性(5)20℃低於酶的最適溫度，酶活性低，水解產生的還原糖少