❶ 腐草黴素可以篩選哺乳動物細胞嗎
你指的是精母細胞（卵母細胞）還是精子（卵細胞）？前者是可以體外培養的，但是後者由於已經高度分化不會在像體細胞一樣分裂。所以不能體外增值
❷ 紅細胞不規則抗體篩選實驗
不規則抗體篩選實驗有紅細胞不規則抗體篩選實驗，紅細胞不規則抗體篩選實驗對於輸血來說是很有意義的，可以預防輸血出現的一系列不良情況，做紅細胞不規則抗體篩選實驗有一些事項要注意，接下來我們來具體說下紅細胞不規則抗體篩選實驗的相關知識吧。
紅細胞不規則抗體篩選實驗目的
不規則抗體篩選有紅細胞不規則抗體篩選，那麼紅細胞不規則抗體篩選實驗目的是什麼呢？
由於有臨床意義的紅細胞不規則抗體會導致溶血性輸血反應，破壞輸入的不配合的紅細胞或縮短其壽命，產生溶血性輸血反應，輕則影響治療效果，重則危機病人生命；此外，對孕婦而言，不規則抗體會引起新生兒溶血病，影響新生兒臟器的發育，並使其智力發育受到傷害，嚴重者則會危及新生兒的生命安全。因此，抗篩選是很必要而且必須的。
對需要輸血治療的患者，進行紅細胞不規則抗體篩查，可以有助於血液選擇，從而有充分的時間來選擇不含有針對某抗體的響應抗原的血液，從而防止因為輸注含有某抗體相應抗原的血液而引起溶血性輸血反應，保證輸血安全。
紅細胞不規則抗體篩選實驗意義
紅細胞不規則抗體篩選實驗比較少見，那麼紅細胞不規則抗體篩選實驗意義是什麼呢？
紅細胞不規則抗體的檢測與臨床輸血的安全性和有效性密切相關。隨著輸血技術的發展，紅細胞不規則抗體的檢測方法不斷豐富、檢測水平不斷提高，越來越多的不規則抗體被發現。因此，輸血技術人員有必要深入了解不規則抗體的重要性。
本身紅細胞也稱紅血球，在常規化驗中英文常縮寫成RBC，是血液中數量最多的一種血細胞，同時也是脊椎動物體內通過血液運送氧氣的最主要的媒介，同時還具有免疫功能。哺乳動物成熟的紅細胞是無核的，這意味著它們失去了DNA。紅細胞主要是通過無氧糖酵解來釋放能量，而其中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、丙酮酸激酶就是紅細胞進行無氧糖酵解的必須的酶類。如果這些酶活性下降或缺失，紅細胞就不能進行無氧糖酵解。
紅細胞不規則抗體篩選實驗有必要做嗎
紅細胞不規則抗體篩選實驗不是每個人都做的，那麼紅細胞不規則抗體篩選實驗有必要做嗎？
紅細胞不規則抗體篩選實驗有必要做。本身不規則抗體主要是經輸血或妊娠等免疫刺激產生，在鹽水介質中不能凝集而只能致敏相應抗原的紅細胞，必須通過特殊介質才能使致敏紅細胞出現凝集反應。臨床上通常所稱的「同型血」實際上是指ABO血型系統和Rh血型系統相同，其它紅細胞血型系統未必相同。如果交叉配血不仔細，或者只用鹽水介質配血，則有可能檢查不出ABO血型系統之外的不規則抗體，而此抗體與相應抗原發生免疫反應，可導致溶血性輸血反應的發生。
通常情況下紅細胞可以運輸氧氣，也運輸一部分二氧化碳。運輸二氧化碳時呈暗紫色，運輸氧氣時呈鮮紅色。紅細胞會生成於骨髓之內。紅細胞老化後，易導致血管堵塞，所以會自動返回骨髓深處，由白細胞負責銷毀；或是在經過肝臟時，被巨噬細胞分解成為膽汁。
紅細胞不規則抗體篩選實驗案例
對於紅細胞不規則抗體篩選實驗感受是因人而異的，那麼紅細胞不規則抗體篩選實驗案例有哪些呢？
紅細胞不規則抗體篩選實驗案例為取試管三支，標明Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ並往各管加病人血清（血漿）2滴，加5%篩選細胞（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）各1滴。各加LIM0.7ML，混合均勻後，再各加Polybrene 溶液2滴，並混合均勻。用BASO專用離心機1000G離心力，離心10秒，然後把上清液倒掉，不要瀝干，讓管底殘留約0.1ML液體。輕輕搖動試管，目測紅細胞有無凝集，如無凝集，則必須重作。最後加入Resuspending 2滴，輕輕轉動試管混合並同時觀察結果。如果凝集散開，表示是由Polybrene引起的非特異性聚集，抗體篩檢結果為陰性；如凝集不散開，則為紅細胞抗原抗體結合的特異性反應，抗體篩檢結果為陽性，應進一步作抗體鑒定。
雖然紅細胞不規則抗體篩選陽性率僅為0.37%，但是該項陽性的患者一旦輸入具有相應抗原的紅細胞，抗原、抗體發生免疫性結合，在補體的參與下，使輸入的紅細胞發生溶解，即發生溶血性輸血反應。患者出現發熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿，嚴重時甚至危及其生命。因此，在輸血中要經常警惕這種輸血反應發生的可能性。當紅細胞不規則抗體篩選陽性時，必須進一步作抗體鑒定，確定其特異性後，再輸入無相應抗原的紅細胞，才能達到安全輸血之目的。
❸ G418原代細胞如何篩選
博凌科為解答：分析轉化的功能和表達需要DNA穩定轉染至宿主細胞染色體。外源基因進入細胞後，部分能夠通過細胞質進入細胞核內，根據細胞類型，至多80%的進入 核內的外源DNA得到瞬時表達。極少數情況下，進入細胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，形成巨大的***結構最終整合進細胞染色體。細胞 基因組自由部分表達，所以整合並不一定意味著表達，只有整合到表達區的基因才會表達，而且整合到不同的染色體區段的外源基因的表達的量也是不同的。由於攝 取、整合、表達外源基因是小概率事件，通常根據新表型篩選穩定轉染體。一般情況下這種新表型由共轉染的編碼抗生素抗性基因提供。細菌Tn5轉座子序列 （neo抗性基因）攜帶的氨基糖苷磷酸轉移酶可以將G418轉變成無毒形式。G418是一種氨基糖類抗生素，其結構與新黴素、慶大黴素、卡那黴素相似，它 通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質合成，對原核和真核等細胞都有毒性，包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞，也包括原生動物和蠕蟲。是穩定轉染最常用 的選擇試劑。當neo基因被整合進真核細胞基因組合適的地方後，則能啟動neo基因編碼的序列轉錄為mRNA，從而獲得抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶的高效 表達，使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養基中生長。G418的這一選擇特性，已在基因轉移、基因敲除、抗性篩選以及轉基因動物等方面得以廣泛 應用。在進行轉染時細胞膜受到影響，抗生素可能對細胞產生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉讓時不加其它抗生素。其實G418本身有很好 的殺菌效果，在用G418進行篩選的過程中很少會發生污染。但有一點，其實我覺得問題也不是很大，那就是：在老外的一本實驗手冊中提到，在脂質體轉染時所 用培養基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂質體對細胞膜有影響，可能此時加抗生素對細胞損傷較大。因為慶大黴素、鏈黴素、G418均是氨基糖甙 類葯物，其葯理作用完全一樣。所以沒有必要再用，而且由於另外抗生素的添加實際增加氨基糖甙類葯物的濃度，劑量有誤差，不利於各實驗室之間的交流，在實際 操作中，培養液中有抗生素對細胞培養與篩選影響不大。Protocal1.G418的配製： 取1g G418溶於1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。2.細胞培養：取待測培養細胞，制備成細胞懸液，按等量接種入多孔培養板中，培養6小時左右開始加葯。3.制備篩選培養基：在100g/ml～1000g/ml范圍內確定幾個梯度，比如先做個100g/ml、400g/ml、800g /ml、1000g/ml，按梯度濃度用培養基稀釋G418製成篩選培養基。4.加G418篩選： 吸除培養孔中培養基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養基。5.換液：根據培養基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養基。方法同4。6.確定最佳篩選濃度：在篩選10～14天內能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不 大，最有可能的是出現這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天後還不能殺死細胞，而用下一個梯度的G418的量在10天前就看不到活細胞了。假如是 400g/ml不能殺死細胞，而800g/ml在第5天就把所有細胞都殺死了，則可以再用500g/ml、600g/ml、700g/ml進一 步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由於特性明確的細胞系G418的最佳用量還是比較穩定的，所以有時候不需要在這么大范圍內進行篩選。比如說你要轉染 NIH3T3細胞，現在我告訴你我測試過NIH3T3細胞對G418的敏感性，我用的篩選濃度是200g/ml。這時你就可以做150g/ml、 200g/ml、300g/ml三個濃度進行篩選
❹ 求穩定細胞株篩選的protocol，求助各位大神
穩定細胞株篩選是一個長期的過程，穩定細胞株篩選優化，有許多條件需要摸索，而且是從源頭開始
① 在構建載體時，目的基因直接整合到細胞染色體組上，最好不要通過先瞬轉在篩選穩定細胞株的這種方法，因為轉染效率沒有保證
② 高表達載體的構建，哺乳動物表達量一直是它自身的缺點，最好根據高表達載體定向的馴化細胞，提高蛋白表達量
③ 細胞的選擇，篩選穩定細胞株我們常用的細胞是CHO，中國倉鼠卵巢細胞，由於CHO具有諸多的優點因此適合用於篩選穩定細胞株，而HEK293細胞則常用於瞬時轉染
④ 後期的篩選，雙抗預防污染，篩選細胞的時候抗生素濃度一定要做預實驗，而且轉染的時候不能有抗生素，關於細胞轉染 穩定細胞系構建的相關理論
❺ 哺乳動物的紅細胞怎麼提取
利用紅細胞在低滲液中吸水漲破的原理破裂紅細胞，並利用紅細胞膜蛋白與血紅蛋白分子量的不同，通過高速離心分離紅細胞膜蛋白和血紅蛋白。
採用NH4Cl作為低滲液。
人紅細胞膜的提取:取人全血按1:4的比例加入
0.9%NaCl（生理鹽水）離心，去上清；將沉澱用生理鹽水1:1稀釋，加入等量的淋巴細胞分離液，離心取最下層的紅細胞沉澱，按1:20的比例加入紅細胞膜裂解液，4度處理2h，離心去上清，收集乳白色沉澱。
❻ 關於克隆
克隆一詞是英文單詞clone的音譯，作為名詞，c1one通常被意譯為無性繁殖系。同一克隆內所有成員的遺傳構成是完全相同的，例外僅見於有突變發生時。自然界早已存在天然植物、動物和微生物的克隆，例如：同卵雙胞胎實際上就是一種克隆。然而，天然的哺乳動物克隆的發生率極低，成員數目太少（一般為兩個），且缺乏目的性，所以很少能夠被用來為人類造福，因此，人們開始探索用人工的方法來生產高等動物克隆。這樣，克隆一詞就開始被用作動詞，指人工培育克隆動物這一動作。
目前，生產哺乳動物克隆的方法主要有胚胎分割和細胞核移植兩種。克隆羊「多莉」，以及其後各國科學家培育的各種克隆動物，採用的都是細胞核移植技術。所謂細胞核移植，是指將不同發育時期的胚胎或成體動物的細胞核，經顯微手術和細胞融合方法移植到去核卵母細胞中，重新組成胚胎並使之發育成熟的過程。與胚胎分割技術不同，細胞核移植技術，特別是細胞核連續移植技術可以產生無限個遺傳相同的個體。由於細胞核移植是產生克隆動物的有效方法，故人們往往把它稱為動物克隆技術。
採用細胞核移植技術克隆動物的設想，最初由漢斯·施佩曼在1938年提出，他稱之為「奇異的實驗」，即從發育到後期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出細胞核，將其移植到一個卵子中。這一設想是現在克隆動物的基本途徑。
從1952年起，科學家們首先採用青蛙開展細胞核移植克隆實驗，先後獲得了蝌蚪和成體蛙。1963年，我國童第周教授領導的科研組，首先以金魚等為材料，研究了魚類胚胎細胞核移植技術，獲得成功。
哺乳動物胚胎細胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡爾·伊爾門澤和彼得·霍佩用鼠胚胎細胞培育出發育正常的小鼠。1984年，施特恩·維拉德森用取自羊的未成熟胚胎細胞克隆出一隻活產羊，其他人後來利用牛、豬、山羊、兔和獼猴等各種動物對他採用的實驗方法進行了重復實驗。1989年，維拉德森獲得連續移核二代的克隆牛。1994年，尼爾·菲爾斯特用發育到至少有120個細胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年，在主要的哺乳動物中，胚胎細胞核移植都獲得成功，包括冷凍和體外生產的胚胎；對胚胎幹細胞或成體幹細胞的核移植實驗，也都做了嘗試。但到1995年為止，成體動物已分化細胞核移植一直未能取得成功。
二、克隆羊「多莉」的意義和引起的反響
以上事實說明，在1997年2月英國羅斯林研究所維爾穆特博士科研組公布體細胞克隆羊「多莉」培育成功之前，胚胎細胞核移植技術已經有了很大的發展。實際上，「多莉」的克隆在核移植技術上沿襲了胚胎細胞核移植的全部過程，但這並不能減低「多莉」的重大意義，因為它是世界上第一例經體細胞核移植出生的動物，是克隆技術領域研究的巨大突破。這一巨大進展意味著：在理論上證明了，同植物細胞一樣，分化了的動物細胞核也具有全能性，在分化過程中細胞核中的遺傳物質沒有不可逆變化；在實踐上證明了，利用體細胞進行動物克隆的技術是可行的，將有無數相同的細胞可用來作為供體進行核移植，並且在與卵細胞相融合前可對這些供體細胞進行一系列復雜的遺傳操作，從而為大規模復制動物優良品種和生產轉基因動物提供了有效方法。
在理論上，利用同樣方法，人可以復制「克隆人」，這意味著以往科幻小說中的獨裁狂人克隆自己的想法是完全可以實現的。因此，「多莉」的誕生在世界各國科學界、政界乃至宗教界都引起了強烈反響，並引發了一場由克隆人所衍生的道德問題的討論。各國政府有關人士、民間紛紛作出反應：克隆人類有悖於倫理道德。盡管如此，克隆技術的巨大理論意義和實用價值促使科學家們加快了研究的步伐，從而使動物克隆技術的研究與開發進入一個高潮。
三、近3年來克隆研究的重要成果
克隆羊「多莉」的誕生在全世界掀起了克隆研究熱潮，隨後，有關克隆動物的報道接連不斷。1997年3月，即「多莉」誕生後1個月，美國、中國台灣和澳大利亞科學家分別發表了他們成功克隆猴子、豬和牛的消息。不過，他們都是採用胚胎細胞進行克隆，其意義不能與「多莉」相比。同年7月，羅斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造過的胎兒成纖維細胞克隆出世界上第一頭帶有人類基因的轉基因綿羊「波莉」（Polly）。這一成果顯示了克隆技術在培育轉基因動物方面的巨大應用價值。
1998年7月，美國夏威夷大學Wakayama等報道，由小鼠卵丘細胞克隆了27隻成活小鼠，其中7隻是由克隆小鼠再次克隆的後代，這是繼「多莉」以後的第二批哺乳動物體細胞核移植後代。此外，Wakayama等人採用了與「多莉」不同的、新的、相對簡單的且成功率較高的克隆技術，這一技術以該大學所在地而命名為「檀香山技術」。
此後，美國、法國、荷蘭和韓國等國科學家也相繼報道了體細胞克隆牛成功的消息；日本科學家的研究熱情尤為驚人，1998年7月至1999年4月，東京農業大學、近畿大學、家畜改良事業團、地方（石川縣、大分縣和鹿兒島縣等）家畜試驗場以及民間企業（如日本最大的奶商品公司雪印乳業等）紛紛報道了，他們採用牛耳部、臀部肌肉、卵丘細胞以及初乳中提取的乳腺細胞克隆牛的成果。至1999年底，全世界已有6種類型細胞——胎兒成纖維細胞、乳腺細胞、卵丘細胞、輸卵管／子宮上皮細胞、肌肉細胞和耳部皮膚細胞的體細胞克隆後代成功誕生。
2000年6月，中國西北農林科技大學利用成年山羊體細胞克隆出兩只「克隆羊」，但其中一隻因呼吸系統發育不良而早夭。據介紹，所採用的克隆技術為該研究組自己研究所得，與克隆「多莉」的技術完全不同，這表明我國科學家也掌握了體細胞克隆的尖端技術。
在不同種間進行細胞核移植實驗也取得了一些可喜成果，1998年1月，美國威斯康星一麥迪遜大學的科學家們以牛的卵子為受體，成功克隆出豬、牛、羊、鼠和獼猴五種哺乳動物的胚胎，這一研究結果表明，某個物種的未受精卵可以同取自多種動物的成熟細胞核相結合。雖然這些胚胎都流產了，但它對異種克隆的可能性作了有益的嘗試。1999年，美國科學家用牛卵子克隆出珍稀動物盤羊的胚胎；我國科學家也用兔卵子克隆了大熊貓的早期胚胎，這些成果說明克隆技術有可能成為保護和拯救瀕危動物的一條新途徑。
四、克隆技術的應用前景
克隆技術已展示出廣闊的應用前景，概括起來大致有以下四個方面：（1）培育優良畜種和生產實驗動物；（2）生產轉基因動物；（3）生產人胚胎幹細胞用於細胞和組織替代療法；（4）復制瀕危的動物物種，保存和傳播動物物種資源。以下就生產轉基因動物和胚胎幹細胞作簡要說明。
轉基因動物研究是動物生物工程領域中最誘人和最有發展前景的課題之一，轉基因動物可作為醫用器官移植的供體、作為生物反應器，以及用於家畜遺傳改良、創建疾病實驗模型等。但目前轉基因動物的實際應用並不多，除單一基因修飾的轉基因小鼠醫學模型較早得到應用外，轉基因動物乳腺生物反應器生產葯物蛋白的研究時間較長，已進行了10多年，但目前在全世界范圍內僅有2例葯品進入3期臨床試驗，5～6個葯品進入2期臨床試驗；而其農藝性狀發生改良、可資畜牧生產應用的轉基因家畜品系至今沒有誕生。轉基因動物製作效率低、定點整合困難所導致的成本過高和調控失靈，以及轉基因動物有性繁殖後代遺傳性狀出現分離、難以保持始祖的優良勝狀，是制約當今轉基因動物實用化進程的主要原因。
體細胞克隆的成功為轉基因動物生產掀起一場新的革命，動物體細胞克隆技術為迅速放大轉基因動物所產生的種質創新效果提供了技術可能。採用簡便的體細胞轉染技術實施目標基因的轉移，可以避免家畜生殖細胞來源困難和低效率。同時，採用轉基因體細胞系，可以在實驗室條件下進行轉基因整合預檢和性別預選。在核移植前，先把目的外源基因和標記基因（如LagZ基因和新黴素抗生基因）的融合基因導入培養的體細胞中，再通過標記基因的表現來篩選轉基因陽性細胞及其克隆，然後把此陽性細胞的核移植到去核卵母細胞中，最後生產出的動物在理論上應是100％的陽性轉基因動物。採用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功獲得6隻轉基因綿羊，其中3隻帶有人凝血因子IX基因和標記基因（新黴素抗性基因），3隻帶有標記基因，目的外源基因整合率高達50％。Cibelli（Science，1997）同樣利用核移植法獲得3頭轉基因牛，證實了該法的有效性。由此可以看出，當今動物克隆技術最重要的應用方向之一，就是高附加值轉基因克隆動物的研究開發。
胚胎幹細胞（ES）是具有形成所有成年細胞類型潛力的全能幹細胞。科學家們一直試圖誘導各種幹細胞定向分化為特定的組織類型，來替代那些受損的體內組織，比如把產生胰島素的細胞植入糖尿病患者體內。科學家們已經能夠使豬ES細胞轉變為跳動的心肌細胞，使人ES細胞生成神經細胞和間充質細胞和使小鼠ES細胞分化為內胚層細胞。這些結果為細胞和組織替代療法開辟了道路。目前，科學家已成功分離到人ES細胞（Thomson等1998，Science），而體細胞克隆技術為生產患者自身的ES細胞提供了可能。把患者體細胞移植到去核卵母細胞中形成重組胚，把重組胚體外培養到囊胚，然後從囊胚內分離出ES細胞，獲得的ES細胞使之定向分化為所需的特定細胞類型(如神經細胞，肌肉細胞和血細胞），用於替代療法。這種核移植法的最終目的是用於幹細胞治療，而非得到克隆個體，科學家們稱之為「治療克隆」。
克隆技術在基礎研究中的應用也是很有意義的，它為研究配子和胚胎發生，細胞和組織分化，基因表達調控，核質互作等機理提供了工具。
五、克隆技術存在的問題
盡管克隆技術有著廣泛的應用前景，但離產業化尚有很大距離。因為作為一個新興的研究領域，克隆技術在理論和技術上都還很不成熟，在理論上，分化的體細胞克隆對遺傳物質重編（細胞核內所有或大部分基因關閉，細胞重新恢復全能性的過程）的機理還不清楚；克隆動物是否會記住供體細胞的年齡，克隆動物的連續後代是否會累積突變基因，以及在克隆過程中胞質線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。
在實踐中，克隆動物的成功率還很低，維爾穆特研究組在培育「多莉「的實驗中，融合了277枚移植核的卵細胞，僅獲得了「多莉」這一隻成活羔羊，成功率只有0.36％，同時進行的胎兒成纖維細胞和胚胎細胞的克隆實驗的成功率也分別只有1.7％和1.1％，即使是使用「檀香山」技術，以分化程度較低的卵丘細胞為核供體，其成功率也只有百分之幾。
此外，生出的部分個體表現出生理或免疫缺限。以克隆牛為例，日本、法國等國培育的許多克隆牛在降生後兩個月內死去；到2000年2月，日本全國已共有121頭體細胞克隆牛誕生，但存活的只有64頭。觀察結果表明，部分犢牛胎盤功能不完善，其血液中含氧量及生長因子的濃度都低於正常水平；有些牛犢的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常發育；克隆動物胎兒普遍存在比一般動物發育快的傾向，這些都可能是死亡的原因。
即使是正常發育的「多莉」，也被發現有早衰跡象。染色體的未端被稱為端粒，它決定著細胞能夠分裂的次數：每一次分裂端粒都會縮短，而當端粒耗盡後細胞就失去了分裂能力。1998年，科學家發現「多莉」的細胞端粒比正常的要短，即其細胞處於更衰老的狀態。當時認為，這可能是用成年綿羊的細胞克隆「多莉」造成的，使其細胞具有成年細胞的印記，但這一解釋目前受到了挑戰，美國馬薩諸塞州的醫生羅伯特·蘭扎等用培養的衰老細胞克隆牛，得到6頭小牛，出生5～10個月後發現這些克隆牛的端粒比普通同齡小牛要長，有的甚至比普通新生小牛的端粒還長。現在還不清楚這一現象的原因，也不清楚為何與「多莉「的情況有巨大差別。但這一實驗說明，在一些情況下克隆過程能改變成熟細胞的分子鍾，使其「恢復青春」，關於這種變化對克隆動物壽命的影響，還有待於進一步觀察。
除了以上的理論和技術障礙外，克隆技術（尤其是在人胚胎方面的應用）對倫理道德的沖擊和公眾對此的強烈反應也限制了克隆技術的應用。但幾年來克隆技術的發展表明，世界各科技大國都不甘落後，誰也沒有放棄克隆技術研究。這一點上英國政府的態度非常具有代表性，在1997年2月底宣布中止對「多莉」研究小組投資後不到1個月，英國科技委員會就對克隆技術發表專題報告，表明英國政府將重新考慮這一決定，認為盲目禁止這方面的研究並不是明智之舉，關鍵在於建立一定的規范利用它為人類造福。
❼ 特定細胞是怎麼提取的
免疫細胞從外周血的提取，經過離心、分離及細胞收集，特定的免疫細胞可以通過流式進行分選。
❽ 哺乳動物細胞發育分子追蹤器
多細胞生物僅僅由單個細胞發育而來的整個生物學過程令人震撼。經典的譜系追蹤實驗已經用於追蹤線蟲單細胞到多細胞的發育過程，並發現了細胞譜系和表型方面的差異。但更復雜的生物體是如何精妙地調控細胞的發育過程仍不清楚。
線蟲作為一種模式生物，其細胞發育的過程已經被研究地較為透徹，但高等生物尤其是哺乳動物中細胞的發育過程異常復雜，沒有很好的工具來記錄細胞發育的大跨度發育過程。
目前，以CRISPR-Cas9為基礎的技術已被用於記錄細胞譜系發生，整合scRNA測序技術揭開了胚胎發育神秘的面紗。然而這些研究的barcode缺乏多樣性，很大程度上限制了在其他生命體中的應用。
為了進一步揭開哺乳動物早期胚胎發育過程，作者 基於CRISPR-Cas9技術開發了一套細胞譜系追蹤記錄器 ，為小鼠原腸胚發育過程的研究提供了可用的工具。
理想的多細胞生物發育分子追蹤器需要滿足以下要求：
首先設計包含熒光蛋白的分子追蹤器模型，驗證追蹤器模型的可行性。
靶點設計
a. 合成的靶點包含3個切割位點
b. 包含8 bp整合的barcode
c. 連接於熒光蛋白的3`非編碼區
sgRNAs
使用Cas9產生雙鏈斷裂修復後造成可遺傳的插入或者缺失突變。用於記錄信息的是包含3個切割位點以及8鹼基對的「整合條碼」205個鹼基對的合成DNA。該合成DNA序列被嵌入組成型轉錄的熒光蛋白3`非翻譯區，從而能夠通過熒光從轉錄組中分析實驗結果。另外一個cassette編碼了三個guide RNA，可用來記錄多種信號。
基於構建好的分子追蹤器模型來進行切割實驗和性能驗證。
此基因編輯系統能夠產生大量的可遺傳修復結果和目標位點，並且可以通過整合條碼對這些序列進行區分。
為了篩選能夠控制突變比例的序列，用於長期時間的試驗切割，鏈接GPF報告基因，通過對含報告基因的細胞的比例進行統計（20天的大跨度）。
sgRNA中的突變（單和雙突變）設計在了前間區序列鄰近基序（PAM）的附近，這些guide RNA是作者通過篩選得到的，使用GFP報告基因在超過20天的時間對guide RNA靶標的活性進行監控，從而篩選具有廣泛動態變化范圍的序列。
分子追蹤器模型驗證有效後，進行載體構建和單細胞培養實驗。
開展小鼠細胞實驗，將多個靶點整合到基因組中之後，又將組成型的Cas9-GFP編碼的精子釋放到卵母細胞之中啟動切割，收集E8.5-E9.5胚胎用於下游分析。
基於10x Genomics平台的建庫測序流程示意圖：
為了證明該技術的譜系追蹤能力，他們對於胎盤、卵黃囊以及胚胎局部組織（3小份）中的靶點進行擴增，並且通過插入、缺失標記的相似性來研究這三者之間的關系，從而評估該技術的實用性。
基於細胞表型數據對單細胞進行分配，得到組織層面的單細胞分類結果。
通過細胞形態表達特徵分配細胞，只展示第2號胚胎（1 of 7），共注釋了22,264細胞，能將細胞進行很好的分類。
基於已知的maker基因對單細胞進行分類和注釋。
該圖展示了典型的組織marker基因，按照不同的胚層進行分類（marker陽性細胞減少），但是特異性較高。
點的大小代表marker基因陽性的細胞比例，顏色代表歸一化的表達量（cluster mean值）。
基於插入、缺失標記多態性構建細胞譜系的進化樹，來構建細胞發育的過程。
（1）譜系進化樹的構建
基於InDel加權log-likelihoods值，構建譜系進化樹，並將細胞類型信息疊加進行標記，從進化樹的根部到分支可以發現細胞類型是逐漸特化的。其中，每一個分支代表一個InDel生成事件。
（2）單細胞排序策略
通常來說軌跡分析常用於細胞排序，本文使用改良後的漢明距離來評估成對細胞間的譜系距離。
基於單細胞測序結果建立系統發育樹後發現，細胞譜系發育距離越近，轉錄譜的相似度越高，該結果與細胞在發育過程中逐漸分化成特化的細胞類型相一致。
經過分析，部分單細胞的真實來源與譜系分析結果並不一致。
胚外內胚層 (EEndo)和胚胎內胚層 (Endo)分別起源於下胚層和上胚層，但祖源打分很高。
Endo和EEndo祖源打分很高說明兩組細胞很來源一致，但是其真正起源卻截然不同。原因是部分Endo細胞被分配給了EEndo分支。
分離Endo胚胎內胚層譜系細胞，繪制譜系樹，發現部分細胞中Trap1a和Rhox5（EEndo標記基因）高表達。其他的胚胎中均發現這個現象。
對不同類型的胚胎組織細胞進行譜系追蹤溯源和比例計算，從而對細胞發育圖譜過程中各種細胞類型進行定量。
圖a：起源於多能祖細胞的組織分布比例，多能細胞形成所有的胚層，但對不同的細胞命運表現出不對稱的傾向。（灰色的為node，星號標記，生成原始生殖細胞），橫軸是譜系（n為細胞數目）圖b：灰點代表胚胎，連線連接著相同胚胎的估計。
一、開發了基於CRISPR-Cas9的工具用於追蹤細胞發育進程
二、實現了哺乳動物原腸胚形成過程細胞命運譜系示蹤
三、實現較長時間跨度下各發育階段的細胞狀態追蹤和定量
四、可用於構建哺乳動物整個發育時期細胞命運圖譜
Chan, M.M., Smith, Z.D., Grosswendt, S. et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature 570, 77–82 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-1184-5
❾ 信號肽昨天我已經找到了。還有個問題，
哺乳動物細胞表達異源蛋白質，構建的基因轉錄的出mRNA必須是單順反子。所以你的兩個抗體鏈需要兩個啟動子來驅動表達。
兩個基因要同時轉到一種細胞里去，可以考慮將兩個基因分別構建兩個載體，然後進行共轉染，再篩選陽性細胞；
或者，先向細胞系轉染一個載體，篩選出陽性細胞之後，再向其轉染另一個載體，最後篩選出兩種基因都表達的細胞系。
❿ G418的選擇細胞原理是什麼
G418的選擇細胞原理：
由於每種細胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內進行篩選，選擇出在10~14天內使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。
由於每種細胞對G418的敏感性不同，一般變動在100ug/ml～1000ug/ml范圍。在篩選之前，一定要確定細胞對這一批G418的最佳篩選濃度。盡管如此，特性明確的細胞系G418的最佳用量還是穩定的。《分子克隆》給出了幾個常用細胞系所需G418的最佳用量。
由於基因轉染到細胞內之後要一段時間才能表達出蛋白質。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性克隆，一般要在轉染24小時之後才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都會下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時葯物濃度可以降至200ug/ml。
加葯篩選約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現兩個問題：1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡。2.孔中細胞數目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養液：假如你要轉染3T3細胞，在3T3細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養過夜之後收集培養液，通過濾器消毒，和新鮮的培養液按1：1混合備用。再轉染後篩選過程中就可以應用這種培養基。
為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應用套環法或刮除法結合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加葯後，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認，在陽性克隆下用記號筆做個標記。然後刮除陰性克隆，消化陽性克隆後繼續篩選培養；或者用套環套住陽性克隆，在套環內加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個新的孔中培養。最後再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。
一般經過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機整合，會導致表達的目的蛋白的量產生很大差異。隨著培養時間的延續，那些丟失了外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會占據優勢，強表達目的蛋白的細胞會越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經過2次以上的篩選之後才能找到那種我們想要的強分泌目的蛋白的，遺傳穩定的細胞克隆。
G418（Geneticin,遺傳黴素） 是一種氨基糖苷類抗生素 ,在分子遺傳試驗中，是穩定轉染最常用的抗性篩選試劑。它通過抑制轉座子Tn601，Tn5 的基因,干擾核糖體功能而阻斷蛋白質合成，對原核和真核等細胞產生毒素 ,包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞 ,也包括原生動物和蠕蟲。當neo基因被整合進真核細胞DNA後 ,則能啟動neo基因編碼的序列轉錄為mRNA ,從而獲得抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶的高效表達 ,使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養基中生長。G418的這一選擇特性 ,已在基因轉移、基因敲除、抗性篩選以及轉基因動物等方面得以廣泛應用。