動物組織測細胞因子可以冰凍多久

1. 測細胞因子 可以液氮快速凍融裂解細胞嗎

反復凍融法裂解細胞：
1、將細胞在-20
度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
2、至少3次以上凍溶。
3、IFCC推薦法： 收集細胞懸液，4℃低溫離心（3000rpm，5min），棄上清，加入一定量PBS（200ul），輕輕吹打混勻，-200C 冷凍30 min，370C 解凍，如此反復3次，可形成細胞裂解液。
4、用液氮凍融三四次就可以了，細胞凍住後，取出放37度水浴，溶解後震盪，再凍

2. 做SOD檢測時,由於實驗室條件限制，沒有液氮，動物組織可以直接先凍存再在-80℃冰箱嗎

可以的 一般-80凍不超過三天都沒什麼影響 親測

3. 我准備提取動物組織進行凋亡細胞DNA ladder的檢測，該動物組織再提取DNA之前可否保存，怎麼保存謝謝各位

必須先冷凍,有條件的話,切下組織之後,馬上丟到液氮里速凍,凍透了之後,放在-80冰箱里保存,用之前,放在液氮里,然後再研缽中加液氮,快速研磨,OVER

4. 全血標本凍存後可以測細胞因子嗎

1、取血後最好能放到37度水浴箱中1小時左右,這樣有助於纖維蛋白原凝集,在凍得時候也最好不要把血清和血細胞一起凍,血細胞反復凍融會破碎,裡面的物質很容易混到血清中,而且血清凍後再放到室溫作試驗,實際上血清裡面會產生分層,你取得部分並不能代表血清整體情況,你做試驗前血清融化後需要混勻才可以,而你帶著血細胞怕不好混勻吧,所以我覺得最好不要一起凍
2、如何解凍血清才不會使產品質量受損?
我們建議您將血清從冷凍箱取出後，先置於2～8℃冰箱使之溶解，然後在室溫下使之全溶。但必須注意的是，溶解過程中必須規則地搖晃均勻。
3、血清解凍後發現有絮狀沉澱物出現， 該如何處理?
血清在解凍過程（包括沒有完全解凍）或儲存在2-8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如凝集素、纖維蛋白原和玻連蛋白等）可能會聚集成團，形成絮狀沉澱或外觀混濁；在運輸過程中，由於時間較長，所以往往有少許解凍，因此也可能稍有沉澱，但這些都不影響血清性能。若您欲去除這些絮狀沉澱物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養基內一起過濾

5. 檢測某種細胞因子在腫瘤組織中的表達情況需要同時做pcr跟western blot 嗎

大鼠灌注取腦；用途：；1.用於常規HE染色，免疫組化分析；2.冰凍切片可以不做腦組織固定；3.不可用於westernblot和PCR；4.如果觀察腦組織的缺血、損傷或其它病變時，不作；原理：；心臟灌流術能夠快速沖凈血液並在動物死亡前進行組織；必要性：；1.腦組織較軟，且細胞成分不易保留，腦組織是較易；2.經前固定後，取腦操作時，可減少腦組織損傷；3.腦內血液

大鼠灌注取腦

用途：

1. 用於常規HE染色，免疫組化分析。

2. 2.冰凍切片可以不做腦組織固定。

3. 3.不可用於western blot和PCR。

4. 4.如果觀察腦組織的缺血、損傷或其它病變時，不作灌注固定，而是在取出腦組織後作固定，將大大影響效果。

5. 原理：

6. 心臟灌流術能夠快速沖凈血液並在動物死亡前進行組織的前固定,避免了組織的自溶現象,是腦組織切片觀察的常用方法。多聚甲醛使組織蛋白發生交聯，以保持蛋白的原位和表面結構不變，從而能使其對應的抗體准確檢測其表達位置和量。

7. 必要性：

8. 1.腦組織較軟，且細胞成分不易保留，腦組織是較易軟化的組織之一，血供也較為豐富，所以最好是在取腦組織前用4％多聚甲醛灌注固。

9. 2.經前固定後，取腦操作時，可減少腦組織損傷。

10. 3.腦內血液都在，HE染色後，可去除紅細胞背景影響。

11. 大鼠灌注取腦標准操作規程(SOP)：

12. 流程：

13. 1) 麻醉 2)開胸 3)心臟左心室穿針,剪開右心耳 4)生理鹽水沖水 5)4%多基甲醛固定 6)取腦 7)保存或切片.

14. 具體過程：

15. 大鼠經深度麻醉後，固定於自製的木板上,置於解剖盤中,開胸暴露並游離出心臟,經左心室插入灌流針並固定, 切開右心耳,先灌注冰凍無菌生理鹽水(4℃)XmL，直到肝和肺臟顏色轉白及右心房流出液澄清,後再灌注冰凍(4℃)4%多聚甲醛XmL,斷頭取腦,多聚甲醛浸泡固定24小時。

16. Tips：

17. 1.多聚甲醛的配置：

18. 一般方法為：4％多聚甲醛PBS緩沖液配法：稱取40g PFA溶於裝有500mlDEPC水的玻璃容器（燒杯或燒瓶）中，持續加熱磁力攪拌至60～65℃，使成乳白色懸液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮狀（滴加），再加入約500ml PBS，充分混勻（在冰浴或冷水浴中），可再檢測一下pH，過濾後定容至1000ml，室溫或4℃保存備用。

19. 簡便方法：先配好PBS，稱好相應的多聚甲醛，37℃水浴或溫箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期間不時震盪。注意，4%的多聚甲醛需臨用前配製,配製後需過濾去除小的雜質,避免心臟灌流時造成栓塞影響灌流效果。

20. 2.製作灌注裝置，用兩瓶塑料包裝的輸液瓶裝灌注液。同時配好輸液器備用。

21. 3.10％水合氯醛按4mL/100g的劑量腹腔麻醉動物。

22. 4.沿兩側肋弓剪開皮膚，打開腹腔，用一血管鉗夾持劍突並向上提拉，用彎剪在膈肌與胸骨柄相連處剪一小口，造成人工氣胸，然後向兩側順延，剪斷膈肌及肋骨，夾持劍突的血管鉗將劍突連帶胸廓上翻固定，充分暴露心臟，直視下穿刺針左心室心尖處，用血管鉗固定。

23. 5.快速滴注生理鹽水(室溫)，同時剪開右心耳。約注入100~150mL，至流出液體血色較淺基本澄清，停止灌注。肝臟、眼珠、爪子迅速變白是排液的有效觀察指標。

24. 6.繼續用4%多聚甲醛灌流250ml固定。

25. 7.後固定：灌流後的腦組織置於4％PFA置4度冰箱內進行後固定，時間>2h，過夜最好。

26. 補充：

27. 還有一種省時省劑的方法。

28. 夾閉腹主動脈：只灌註上肢及頭腦，固定的好又快，又省試劑。先灌注生理鹽水約100ml，見到老鼠兩前肢及兩肺變白可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。

29. 灌注成功的標志：剛開始灌注時老鼠前肢劇烈抽動（下肢不抽動證明腹主動脈夾閉完全）；前肢及頸部僵硬；所灌注的腦組織白而硬。

30. 
    

6. 想做冰凍切片我要怎麼准備動物組織

冰凍切片是不需要固定的,冰凍切片新鮮取材後，應立刻放入冰凍切片機內切片。如不能立即切片，要放入液氮中速凍，然後放在-70度低溫冰箱內長期保存抗原性不會丟失。
在手術台上取下的組織放到冷凍機裡面-20度左右凍成硬塊,製成切片用於快速診斷,該診斷僅作參考,應以石蠟診斷為主。
低溫恆冷箱冷凍切片製作法以Shandon As 620 E型恆溫箱冷凍切片機為例，該機的箱面上有電子控制板，裝有即時冷凍鍵和除霜鍵，啟動即時冷凍鍵，機器馬上進行工作狀態，並可持續10mins。啟動即時除霜鍵，可將工作間頂部後面的製冷柵上的霜除掉

7. 常用的細胞因子檢測方法有哪些

（1）生物學檢測法：又稱生物活性檢測，是根據細胞因子特定的生物活性而設計的檢測法。生物活性檢測法又可分為： 1、細胞增殖法； 2、靶細胞殺傷法； 3、細胞因子誘導的產物分析法； 4、細胞病變抑製法。
（2）免疫學檢測法：細胞因子均為蛋白或多肽，具有較強的抗原性，可利用抗原抗體特異性反應的特性，用免疫學技術定量檢測細胞因子，常用的方法包括ELlSA、RlA及免疫印跡法
（3）分子生物學方法：目前公認的細胞因子的基因均已克隆化，較容易地得到某一細胞因子cDNA探針或根據已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探針。常使用斑點雜交、Northernblot、逆轉錄PCR，細胞或組織原位雜交等。具有靈敏、快速等優點，甚至從l～10個細胞中就可檢出其中的特異mRNA

8. 細胞因子檢測方法哪位了解，好一些的生物學科網有哪些

目前，細胞因子已廣泛應用於臨床的已有EPO、IFN-α、G-CSF、GM-CSF以及試用於臨床的白細胞介素等。為了研究細胞因子在生理系統的作用以及了解細胞因子產品用於臨床治療的效果，進行細胞因子的檢測就必不可少，而且用於臨床診斷的細胞因子分析方法必須適用於常規操作。細胞因子的檢測尚未在臨床診斷上廣泛開展，已知目前採用的細胞因子檢測方法均不完善，且不同的檢測方法所得的結果差異較大，給臨床治療帶來一定的困難。因此，有必要了解各種檢測方法的特性及影響細胞因子濃度的因素。 1 原理和方法細胞因子的發現依賴於其生物學活性，因此，建立了生物分析法用於細胞因子的檢測。隨後，用於檢測實驗溶液(如組織培養上清液)中細胞因子的免疫分析法被建立，並不斷用於實驗室研究。但准確地、可重復地測定細胞因子具有一定困難，主要原因是眾所周知的細胞因子的含量極低(大部分都是以pmol/L計)，同時存在著源於異嗜性抗體，類風濕因子以及特異的和非特異的細胞因子結合蛋白等的顯著干擾。在生物幫那裡可以詳細的了解一下，那裡有很多實驗領域的精品技術文件，並且圖文並茂，提供生物領域的學科知識、實驗技術方法與技巧等please click to connect www.bio1000.com/zt/cell/46213.html .that can help you細胞因子生物學活性檢測和濃度測定的分析方法主要有以下幾類。1.1 生物分析法 生物分析法方便，敏感性高，但所有細胞系有可能受幾種細胞因子的影響，特異性則較差。又由於可溶性細胞因子受體等抑制劑的存在，使生物分析法可能低估細胞因子的活性。常用的方法有2種:(1)依賴性細胞株增敏實驗。一些腫瘤細胞株依賴於細胞因子方能在體外增殖，如TF-1細胞株依賴於GM-CSF和IL-3，CTLL細胞株依賴於IL-2，TTD-1細胞株依賴於IL-6等 。可利用這些依賴株檢測相應的細胞因子。但是，並非所有細胞因子均有相應的依賴株，因此限制了此法的應用。(2)功能檢測實驗。利用一些細胞因子的功能特性而建立相應的活性測定方法。如IFN抗病毒實驗和TNF對L 929 細胞的殺傷作用等 。此外，生物分析法還有骨髓集落形成實驗，細胞毒或細胞抑制實驗，次級分子分泌的誘導，化學趨化和細胞因子分泌性的抑制實驗等。1.2 免疫分析法 利用抗原機體反應的原理，制備出抗細胞因子的單抗或多抗，可進行細胞因子的免疫檢測，它包括放免實驗(RIA)和酶聯免疫吸附實驗(ELISA)等。其優點是高特異性、高靈敏度、操作簡便。缺點是不能證明被測細胞因子是否為具有完整生物活性結構的蛋白質而非變性蛋白質。1.3 CKmRNA的測定 (1)分子雜交實驗:首先制備出細胞因子的基因探針，通過分子雜交檢測細胞內CKmRNA的表達。(2)逆轉錄PCR(RT-PCR)法技術:可快速、靈敏地檢測表達很低的CKmRNA，並可同時測定同一樣本中多種CKmRNA，操作過程包括細胞因子產生細胞的RNA提取，mRNA經逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，在細胞因子引物的引導下，即可進行PCR擴增。根據定量CKmRNA方法和原理的不同，可分為半定量PCR法，競爭性定量PCR法，內參標定量PCR法，HPLC-PCR法和酶聯免疫定量PCR法。目前市售的商品試劑盒已能用於大多數細胞因子的檢測，但因其價格昂貴而阻礙了其廣泛使用。同時，人細胞因子的測定仍存在許多問題，檢測方法選擇不當可能得到不一致的結果，有時有必要選擇一個以上的檢測方法測定細胞因子。 2 靈敏度細胞因子具有很強的生物學活性，其生物分析法的靈敏度極高。然而，在測定血漿中細胞因子正常濃度時，難以確定免疫分析法令人滿意的靈敏度。不同細胞因子的參考值變化很大，難以定義其參考值范圍。如Damas等[7] 在研 究細胞因子與敗血症時，使用兩步免疫放射測定實驗(IRˉMA)測定IL-6(靈敏度:5ng/ml)一步IRMA法測定TNF-α(靈敏度:5ng/L)和IL-1β(靈敏度:4ng/L)，在正常血清中未測得上述細胞因子。而Riikonen等使用具有相似檢測限的RIA法，在20例健康兒童中，IL-1β的平均濃度為12.1ng/L，IL-6的平均濃度為83ng/L;在71例健康兒童中，TNF-α的平均濃度為40±2ng/L。由此可見，不同的免疫分析方法之間存在極大的差異，其靈敏度變化可能是由於其准確度和特異性的不同而引起。3 准確度和特異性影響細胞因子檢測准確度和特異性的因素有:(1)抗體:單抗的表位識別;(2)細胞因子:多種分子形式，結合蛋白復合物、抑制劑和可溶性受體復合物;(3)血漿基質:干擾抗體，異嗜性抗體和類風濕因子;(4)標准:重組參考物質可能不顯示與樣品平行的劑量———反應曲線。3.1 細胞因子結合蛋白 已知IL-1β、TNF-α和IL-6能結合從細胞進入血漿的可溶性受體或特異的拮抗劑。免疫分析法是否能識別這樣的結合形式幾乎是未知的，但是對TNF的研究得出了一些重要結論。20世紀80年代後期，《Lancet》上發表了大量關於癌症病人TNF-α測定缺乏可靠性和生物分析法與免疫分析法關系的文章。但使用競爭性免疫分析法時，癌症病人與敗血症病人的TNF-α是可被檢測的。而ELISA法由於不能測定TNF-α與P 55 TNF受體的結合物而無法測定癌症病人血漿中的TNF-α。3.2 血漿中包含幾種形式的IL-6分子，它們與一些抗血清的作用較弱，缺乏生物學活性並與其它血漿蛋白質以及IL-6的可溶性受體組成復合物。已知IL-6免疫分析法和生物分析測定其在正常血清中的濃度為0或在10～75ng/L范圍，敗血症病人的IL-6濃度升高到1～2μg/L，腦膜炎病人的IL-6濃度升到200μg/L。然而，May等說明大多數的檢測方法僅僅測定了低分子量的IL-6，他們採用能識別IL-6高分子量的單抗，測得在正常血清中IL-6的濃度為1～10μg/L，並且在1例骨髓移植後病人的血清樣品中，測得IL-6的濃度為5～10mg/L。3.3 多種分子的形式 一些細胞因子的多種分子形式已被充分認識，但是其對細胞因子測定影響的重要性並未得到徹底的研究。IL-6是一個最好的例子，它由一個位於第7染色體上，包含5個外顯子的單一多傑基因編碼。其氨基酸序列包括幾個潛在的O-糖基位點，2個N-糖基位點和幾個絲氨酸磷酸化位點。由細菌產生的重組IL-6的相對分子量為21Kd。人成纖維細胞至少分泌6種形式，相對分子量為23～30Kd的IL-6，它們均是糖蛋白，能在敗血症病人的血漿中被檢測。人內皮細胞分泌一種分子量為45Kd的IL-6，它似乎是血漿中的IL-6的主要存在形式。3.4 人血漿中的干擾物質 血漿中通常包含有與IgG反應的抗體。這些異嗜性的抗體可影響夾心免疫分析法，它們在俘獲抗體和被標記的抗體間形成橋梁，而錯誤地導致高分析值。研究表明，15%～40%的病人樣本中含有能夠干擾檢測的抗體。異嗜性抗體能與鼠、兔和牛血清免疫球蛋白發生反應，在大多數情況下，它們與牛IgG的結合最強。在檢測中，加入正常的非免疫動物血清吸附異嗜性抗體，常能夠消除這種形式的干擾。3.5 類風濕因子是IgM的自身抗體 Hamilton等的研究說明，IgM類風濕因子與鼠IgG的結合發生於1%的健康獻血者和31%的類風濕關節炎病人。然而，也有研究表明，在9.1%的正常獻血者中發生了這類結合。這些抗體可造成與異嗜性抗體完全相同的影響，並且他們在對細胞因子檢測具有特別意義的類風濕病患者中的濃度極高。

9. 細胞因子檢測可以用哪些方法，簡述其原理

細胞因子主要是指由內分泌細胞分泌的一類可以參與免疫應答的蛋白多肽。對於細胞因子的檢測方法主要有三種：細胞生物學檢測、免疫學檢測和分子生物學檢測。細胞因子的發現依賴於其生物學活性，因此，建立了生物分析法用於細胞因子的檢測。隨後，用於檢測實驗溶液(如組織培養上清液)中細胞因子的免疫分析法被建立，並不斷用於實驗室研究。但准確地、可重復地測定細胞因子具有一定困難，主要原因是眾所周知的細胞因子的含量極低(大部分都是以pmol/L計)，同時存在著源於異嗜性抗體，類風濕因子以及特異的和非特異的細胞因子結合蛋白等[1，2] 的顯著干擾。

10. 已經凍存的動物組織還可以做冷凍切片嗎

已經凍存的動物組織不可以做冷凍切片。

防止組織中形成冰晶而影響細胞的形態，甚至破壞細胞的結構，在組織冰凍時要採用速凍的方法。組織塊在冰凍時，應根據組織的形狀和結構來放，切片也是如此。

冷凍切片：

1.切片前先安裝好刀片，調整好切片厚度及切片角度。根據標本的組織類型，確定最佳切片溫度。

2.將待切的組織塊平放在軟塑瓶蓋或特質小盆內，直接或塗敷包埋劑後馬上放到冷凍台上冷凍。

3.將凍好的組織塊安裝到組織塊夾持器上，調整好刀片與組織塊之間的角度和距離，調整好防卷板的位置和角度。