A. Western blot實驗需要准備什麼試劑和耗材
試劑：tris、Hcl、Nacl、脫脂牛奶、甲醇、甘氨酸、tuwen20、一抗、二抗、顯色劑及SDS-PAGE需要的試劑（tris、Hcl、TEMED、SDS、過硫酸銨、丙烯醯胺、N,N-甲叉雙丙烯醯胺、甘氨酸、非預染蛋白Marker、甲醇、乙酸、考馬斯亮藍R250）、預染蛋白Marker
耗材：濾紙、PVDF膜或NC膜、乳膠手套等
儀器：電泳儀、電轉槽、搖床、製冰機（電轉時需冰浴）等
B. 動物取材做pcr和wb需要切多大
最低的是6
在大量的文獻中可以看到動物行為學往往要求n=8以上，在高質量的文獻中可見n在20以上，在條件有限的限制下，最低的n的為6
動物實驗結束後，對實驗對象進行病理解剖和取材，以便進行後續的檢測實驗。常規下一般取下實驗對象的臟器、皮膚、腦、具有代表性的病灶及周圍組等常規取材樣本：心臟、肝臟、脾臟、胃、肺臟、腎臟、大腸、小腸、結腸、淋巴結、腎上腺、胸腺、胰腺、子宮、血管、神經等。腦部取材：大腦、小腦、海馬、皮層、下丘腦、垂體等。
C. 由於第一次做western blot ，想請教一個問題，在做WB之前要對培養細胞中的蛋白質進行提取，也就是用裂解
上清液檢測的分泌蛋白 用的是ELISA檢測 細胞裂解液檢測的是胞內蛋白含量。。。。
D. 組織研碎後Trizol一般裂解多長時間
trizol說明書里好像不是很詳細，用起來效果也一般。還是往聖的typhon好用，說明書也很詳細。
RNA的提取
准備試劑
氯仿，異丙醇，75%乙醇，無RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配製)。
操作步驟
1．勻漿處理
a、組織:將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml Typhon；肝臟、腦等柔軟組織用勻漿儀進行勻漿處理。然後加入1mlTyphon，反復輕柔吹打，直至溶液不抽絲，樣品體積不應超過Typhon體積10%。
b、單層培養細胞:去除細胞培養基，PBS沖洗一次，直接在培養板中加入Typhon裂解細胞，每250px2面積加1ml，用移液器吸打幾次，轉移至1.5ml離心管，反復吹打，直至溶液不抽絲。Typhon的用量應根據培養板面積而定。Typhon加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c、細胞懸液:離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml Typhon，反復吸打直至溶液不抽絲。加Typhon之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鍾，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於2-8℃ 12000×g離心10分鍾，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除，取澄清的勻漿液進行下一步操作。
4．第一步每使用1ml Typhon加入0.2ml氯仿，輕柔振盪或吹吸15秒，室溫放置3分鍾。
5．2-8℃ 12000×g離心15分鍾。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色或淡黃色水相，中間為固相。RNA主要在水相中，水相體積約為所用Typhon試劑的60%。
6．把水相轉移到新管中（如要分離DNA和蛋白質可保留有機相），用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml Typhon加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鍾。
7．2-8℃ 10000×g離心10分鍾，離心前看不出RNA沉澱，離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。移去上清。
8．用75%乙醇洗滌RNA沉澱。每使用1ml Typhon至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鍾，棄上清。
9．室溫放置乾燥或真空抽干RNA沉澱，不要晾得過干，否則不易溶解，大約晾5-10分鍾。加入25-200μl無RNase的水或0.5%SDS（本公司均有售），用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鍾使RNA溶解。如RNA用於酶切反應，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲醯胺溶解。-70℃保存。
RNA的提取注意事項
1．從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取RNA是可加入少許糖原以促進RNA沉澱。例如加800μl Typhon勻漿樣品，離心取上清液後，異丙醇沉澱RNA前加5-10ug RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉澱出來，糖原濃度不高於4mg/ml不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。
2．勻漿後加入Typhon，加氯仿之前樣品可在-60—-70℃保存至少一個月。RNA沉澱可保存在75%酒精中2-8℃一個星期以上或-5—-20℃一年以上。
3．分層和RNA沉澱時也可使用低速台式離心機，2600×g離心30-60分鍾。
RNA的提取常見問題分析
得率低：
A.樣品裂解或勻漿處理不徹底
B．RNA沉澱未完全溶解
A260/A280<1.65：
A.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶於水，而溶於了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高。
B.樣品勻漿時加的試劑量太少。
C.勻漿樣品時未在室溫放置5分鍾。
D.吸取水相時混了有機相。
E.RNA沉澱未完全溶解。
RNA降解：
A.組織取出後沒有馬上處理或冷凍
B.待提取RNA的樣品沒有保存於-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.細胞在胰酶處理時過度
D.溶液或離心管未經RNase去除處理
E.電泳時使用的甲醛pH值低於了3.5
DNA污染:
A.樣品勻漿時加的試劑量太少
B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或鹼性溶液
蛋白聚糖和多糖污染:
沉澱RNA的過程中作以下改進可去除這些污染，步驟7中,每使用1mlTyphon在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2MNaCl)混合離心,按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉澱出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應在勻漿後離心，加入以上操作步驟。
DNA的分離
准備試劑
乙醇、0.1M檸檬酸鈉(含10%乙醇)、75%乙醇、8mM NaOH
操作步驟
1．樣品加氯仿分層後,移去上層水相,用乙醇沉澱中間層和有機相中的DNA。每使用1mlTyphon加0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3分鍾，2-8℃不超過2000×g離心5分鍾。
2．移去上清，（如需要分離蛋白質，可保留，進一步操作見後）用含10%乙醇的0.1M檸檬酸鈉洗滌DNA沉澱。每用1mlTyphon加入1ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鍾，2-8℃2000×g離心5分鍾，棄上清，重復一次。
3．用75%乙醇再洗一遍DNA沉澱，每使用1mlTyphon加入1.5-2ml75%乙醇,室溫放置10-20分鍾(不時顛倒混合)2-8℃2000×g離心5分鍾,棄上清。
4．室溫放置晾乾DNA5-15分鍾，用8mMNaOH溶解DNA。從50-70mg組織或10細胞中分離的DNA溶於300-600μl8mMNaOH，DNA的濃度通常為0.2-0.3μg/μl。提取的DNA沉澱不易溶於水和Tris緩沖液中，建議用弱鹼溶解，8mMNaOH的pH值為9，溶解DNA後可用TE、HEPES調節pH。從某些樣品（尤其是組織）中提取的DNA中可能包含一些膠狀不溶物，可>12000×g離心10分鍾除去。
DNA的定量
取一份溶於8mMNaOH的DNA加水測A260值。一單位A260值相當於50μg/ml雙鏈DNA。理論上，人、大鼠、小鼠1×106二倍體細胞含DNA的量約分別為7.1μg,6.5μg,5.8μg。
分離DNA的應用
1．用於PCR 溶於8mMNaOH的DNA用0.1MHEPES調pH至8.4,取0.1-1μgDNA用作PCR模板。
2．酶切反應 用HEPES或1mMEDTA調節pH至適當值。每μgDNA使用3-5單位的酶,酶用量為3-5 IV/mgDNA。
DNA分離注意事項
1．DNA在中間層和有機相中時可在2-8℃保存過夜。
2．DNA沉澱在75%乙醇中2-8℃可保存數月。
3．DNA在8mMNaOH溶液中4℃可放置過夜，如長期保存需用HEPES調節pH至7-8並且加EDTA至1mM可置於4℃或-20℃長期保存。
DNA的分離常見問題分析
得率低
A.樣品勻漿和裂解的不徹底
B.最終得到的DNA沉澱沒有完全溶解
A260/A280<1.70
A.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶於水，而溶於了TE中
B.酚除去不徹底，可用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉澱。
DNA降解
A.組織取出後沒有馬上處理或冷凍
B.待提取RNA的樣品沒有保存於-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.樣品勻漿時使用了高速勻漿儀
RNA污染
A.氯仿分層後水相未完全去除
B.DNA沉澱用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）洗脫不徹底
蛋白質的分離
准備試劑
異丙醇、含0.3M鹽酸胍的95%乙醇、無水乙醇、1%SDS
操作步驟
1．取沉澱DNA後剩餘的上清，用異丙醇沉澱蛋白質。每使用1mlTyphon加1.5ml異丙醇，室溫放置10分鍾，2-8℃12000×g離心10分鍾棄上清。
2．用含0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌蛋白質沉澱。每使用1mlTyphon加2ml洗滌液，室溫放置20分鍾，2-8℃7500×g離心5分鍾，棄上清，重復兩次。用2ml無水乙醇同樣方法再洗一次。
3．真空抽干蛋白質沉澱5-10分鍾，用1%SDS溶解蛋白質，反復吸打，50℃水浴使其完全溶解，不溶物2-8℃10000×g離心10分鍾除去。分離得到的蛋白質樣品可用於Westernblot或-5--20℃保存備用。
蛋白質的提取注意事項
1．蛋白質沉澱可保存在含0.3M鹽酸胍的95%乙醇或無水乙醇中2-8℃一個月以上或-5--20℃一年以上。
2．用0.1%SDS在2-8℃透析三次，10000×g離心10分鍾取上清即可用於Western blot。
蛋白質的提取常見問題分析
得率低：
A.樣品裂解或勻漿處理不徹底
B.最後得到的蛋白質沉澱未完全溶解
蛋白質降解：
組織取出後沒有馬上處理或冷凍
電泳時條帶變形：
蛋白質沉澱洗滌不充分
E. 如何從動物組織中裂解得到蛋白
將組織用液氮研磨碎了，然後按量加入裂解液，細胞量在10七次方左右是100微升。冰浴裂解20分鍾（間斷搖動）。然後4攝氏度離心12000rpm，15分鍾。吸取上清定量。根據測定量的結果將各樣品總蛋白量調勻，然後等體積加入loading buffer就可以電泳了。
因為你最後取得是蛋白量，所以保證最終的總蛋白是相同的量就好了，組織只是提取的介質，我們定量的是最終的蛋白，而並非組織樣品的蛋白含量。如果你想區分兩種不同組織的蛋白含量是不同的，才會用到相同組織量。
在普通陶瓷研缽中就能進行，而且研缽可以不一次性使用。研缽處理的時候需要用錫紙包裹好，通過乾熱法滅菌，120℃烘箱。當然之前要洗干凈。