動物細胞多久進入對數生長期

⑴ 動物細胞培養的基本過程

一、准備工作

准備工作對開展細胞培養異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，准備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。准備工作的內容包括器皿的清洗、乾燥與消毒，培養基與其他試劑的配製、分裝及滅菌，無菌室或超凈台的清潔與消毒，培養箱及其他儀器的檢查與調試。

二、取材

在無菌環境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）後接入培養器皿中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。

理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用於培養，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養，分化程度低的組織比分化高的容易培養，腫瘤組織比正常組織容易培養。

取材後應立即處理，盡快培養，因故不能馬上培養時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。

三、培養

將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養，則直接將組織塊接入培養器皿底部，幾個小時後組織塊可貼牢在底部，再加入培養基。如系細胞培養，一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量（以每毫升細胞數表示）接入培養器皿並直接加入培養基。細胞進入培養器皿後，立即放入培養箱中，使細胞盡早進入生長狀態。

正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態是否正常，有無污染，培養基的PH是否太酸或太鹼（由酚紅指示劑指示），此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。一般原代培養進入培養後有一段潛伏期（數小時到數十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和遊走。過了潛伏期後細胞進入旺盛的分裂生長期。

細胞長滿瓶底後要進行傳代培養，將一瓶中的細胞消化懸浮後分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為「一代」。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。培養正在生長中的細胞是進行各種生物醫學實驗的良好材料。

四、凍存及復甦

為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度—－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞碸或甘油）的培養基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存於液氮中。

在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復甦一般採用快融方法，即從液氮中取出凍存管後，立即放入37℃水中，使之在一分鍾內迅速融解。然後將細胞轉入培養器皿中進行培養。凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復甦時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。

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進入細胞間開始細胞培養時，注意事項：

①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經消毒並檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶液。

②確定衣服的袖口已經捲起或者白大褂的袖口已經扎緊。

③確定酒精燈內的酒精量，需要的話及時進行補充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始前可以把所有瓶蓋旋松。

⑤盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）後在火焰上簡單燒灼。

⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時更換。

⑦實驗完畢及時收拾，保持工作區域清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。

⑵ 細胞工程 動物細胞培養的傳代培養一般是在原代培養的什麼時候或者第幾代

細胞對數生長期 5-10代

⑶ 如何判斷細胞是否處於對數生長期

判斷細胞是否處於對數生長期的方法：
1.
細胞匯合度達到70%-80%時基本上是出於對數期，在顯微鏡下一觀察就可以
。

2.
做生長曲線一作圖。
3.
細胞計數知，養上幾個孔的細胞，每隔1-2天消化一個孔的細胞下來用台盼藍染色血球計數板計數。
4.
如果是簡單的判斷一下，要搞清楚細胞生長的不同時道期，剛開始細胞生長一般是懸浮的，後來貼壁生長，直到生長到長滿瓶底80%時間都是對數期。
細胞的對數生長期：
對數生長期是指細胞在一定的環境下經過了短暫的適應期,進而快速生長的時期，此時期營養充足，細胞會以對數生長，假如原來只有一個細胞,進入對數期以後就會變為兩回個，兩個再變為四個，四個變為八個...即以2的N次方的速度生長(N為細胞的分裂次數)。在對數期生長速率遠遠大於死亡速率，所以在對數期最顯著地特徵就是細胞的數目大量增加，但當細胞經過一定時間的生長會消耗掉營養物質，產生大量的次答生代謝產物使得pH值下降，其生長環境變得惡劣，此時生長速度下降，生長速率和死亡速率平衡，細胞的總個數基本保持不變，細胞的對數生長期結束進入平台期。

⑷ 怎麼看細胞處於對數生長期

對數期細胞大量增值，細胞分裂數遠遠大於細胞死亡數，顯微鏡下觀察，細胞很密，一個挨著一個，細胞間隙小，很明顯的看到細胞呈多邊形，多數細胞處於細胞分裂期，細胞核清晰可見。死亡細胞結構鬆散，或者細胞質破裂，胞液外溢，細胞核辨識不清。如果細胞生長液中加入酸鹼指示劑，對數期的細胞液明顯由紫變紅。

⑸ 動物細胞大規模培養的方法有哪些

動物細胞大規模培養常用方法
根據動物細胞的類型，可採用貼壁培養、懸浮培養和固定化培養等三種培養方法進行大規模培養。

一、動物細胞生長特性及培養溫度
1、細胞生長緩慢，易污染，培養需用抗生素
2、細胞大，無細胞壁，機械強度低，環境適應性差
3、需氧少，不耐受強力通風與攪拌
4、群體生長效應，貼壁生長（錨地依賴性）
5、培養過程產品分布細胞內外，成本高
6、原代培養細胞一般繁殖50代即退化死亡
依據在體外培養時對生長基質依賴性差異，動物細胞可分為兩類：
貼壁依賴型細胞：需要附著於帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長，大多數動物細胞，包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞均屬於這一類。
非貼壁依賴型細胞：無需附著於固相表面即可生長，包括血液、淋巴組織細胞、許多腫瘤細胞及某些轉化細胞。
培養細胞的最適溫度相當於各種細胞或組織取材機體的正常溫度。人和哺乳動物細胞培養的最適溫度為35~37℃。偏離這一溫度，細胞正常的代謝和生長將會受到影響，甚至死亡。總的來說，培養細胞對低溫的耐力比高溫高。溫度不超過39℃時，細胞代謝強度與溫度成正比；細胞培養置於39~40℃環境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復；當溫度達43℃以上時，許多細胞將死亡。當溫度下降到30~20℃時，細胞代謝降低，因而與培養基之間物質交換減少。首先看到的是細胞形態學的改變以及細胞從基質上脫落下來。當培養物恢復到初始的培養溫度時，它們原有的形態和代謝也隨之恢復到原有水平。

二、貼壁培養（attachment culture）
是指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養。
1、生長特性：貼壁依賴型細胞在培養時要貼附於培養（瓶）器皿壁上，細胞一經貼壁就迅速鋪展，然後開始有絲分裂，並很快進入對數生長期。一般數天後就鋪滿培養表面，並形成緻密的細胞單層。
2、貼壁培養的優點：
容易更換培養液；細胞緊密黏附於固相表面，可直接傾去舊培養液，清洗後直接加入新培養液。
容易採用灌注培養，從而達到提高細胞密度的目的；因細胞固定表面，不需過濾系統。
當細胞貼壁於生長基質時，很多細胞將更有效的表達一種產品。
同一設備可採用不同的培養液/細胞的比例。
適用於所有類型細胞。
3、貼壁培養的缺點：與懸浮培養法相比
擴大培養比較困難，投資大；
佔地面積大；
不能有效監測細胞的生長；
4、細胞貼壁的表面：要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機物表面，必須具有親水性，並帶陽電荷。
5、貼壁培養系統：主要有轉瓶、中空纖維（後面專題介紹）、玻璃珠、微載體系統（後面介紹）等。
轉瓶培養系統：培養貼壁依賴型細胞最初採用轉瓶系統培養。轉瓶培養一般用於小量培養到大規模培養的過渡階段，或作為生物反應器接種細胞准備的一條途徑。細胞接種在旋轉的圓筒形培養器-轉瓶中，培養過程中轉瓶不斷旋轉，使細胞交替接觸培養液和空氣，從而提供較好的傳質和傳熱條件。
轉瓶培養具有結構簡單，投資少，技術成熟，重復性好，放大隻需簡單的增加轉瓶數量等優點。 但也有其缺點：勞動強度大，佔地空間大，單位體積提供細胞生長的表面積小，細胞生長密度低，培養時監測和控制環境條件受到限制等。 現在使用的轉瓶培養系統包括二氧化碳培養箱和轉瓶機兩類。
反應器貼壁培養 此種培養方式中，細胞貼附於固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養液一起流動，因此比較容易更換培養液，不需要特殊的分離細胞和培養液的設備，可以採用灌流培養獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產品；但擴大規模較難，不能直接監控細胞的生長情況，故多用於制備用量較小、價值高的生物葯品。
CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應器是常用的貼壁培養式生物反應器，用於細胞貼壁培養時可用籃式攪拌系統和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米無紡聚酯纖維圓片，具很高表面積與體積比（1200cm2/g），利於獲得高細胞密度。籃式攪拌系統和載體培養是目前貼壁細胞培養使用最多方式，用於雜交瘤細胞、Hela細胞、293細胞、CHO細胞及其它細胞培養。此種方式培養細胞，細胞接種後貼壁快。

三、懸浮培養（suspension culture）
是指細胞在反應器中自由懸浮生長的過程。主要用於非貼壁依賴型細胞培養，如雜交瘤細胞等；是在微生物發酵的基礎上發通起來的。
無血清懸浮培養是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養方式，它能減少後期純化工作，提高產品質量，正逐漸成為動物細胞大規模培養的研究新方向。

四、固定化培養（immobilization culture）
是將動物細胞與水不溶性載體結合起來，再進行培養。上述兩大類細胞都適用，具有細胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強等優點，細胞易於產物分開，有利於產物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯法、包埋法、微囊法等。
1、吸附法:用固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法（adhesion）。操作操簡便、條件溫和、是動物細胞固定化中最早研究使用的方法。缺點是：載體的負荷能力低，細胞易脫落。微載體培養和中空纖維培養是該方法的代表，稍後專門介紹。
2、共價貼附法:利用共價鍵將動物細胞與固相載體結合的固定化方法稱為共價貼附法（attachment by covalent bonding）。此法可減少細胞的泄漏，但須引入化學試劑，對細胞活性有影響，且因貼附而導致擴散限制小，細胞得不到保護。
3、離子/共價交聯法:雙功能試劑處理細胞懸浮液，會在細胞間形成橋而絮結產生交交聯作用，此固定化細胞方法稱為離子/共價交聯法（cross-linking by covalent bonding）。交聯試劑會使一些細胞死亡，也會產生擴散限制。
4、包埋法:將細胞包埋在多孔載體內部製成固定化細胞的方法稱為包埋法（entrapment）。優點是：步驟簡便、條件溫和、負荷量大、細胞泄漏少，抗機械剪切。缺點是：擴散限制，並非所有細胞都處於最佳基質濃度，且大分子基質不能滲透到高聚物網路內部。一般適用於非貼壁依賴型細胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。
5、微囊法（microencapsulation）:是用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質及營養物質可自由出入半透膜；囊內是種微小培養環境，與液體培養相似，能保護細胞少受損傷，故細胞生長好、密度高。微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應注意：
溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作；
所用試劑和膜材料對細胞無毒害；
膜的孔徑可控制，必須使營養物和代謝物自由通過；
膜應有足夠機械強度抵抗培養中攪拌。

⑹ 如何判斷細胞生長處於對數期

要判斷細胞生長是否處於對數期，測定細胞生長曲線即可：
一：
在同一規格的培養瓶中，接種同等量的同一代細胞，經培養後每隔24小時取出幾瓶細胞進行計數，以培養時間為橫座標，不同時刻的細胞數的對數為底座標，標出各點並連成線，即為該細胞的生長曲線，可反應出細胞生長的動態。
二：
用96孔/24孔細胞培養板，分7組，每組3孔，培養一周(7天)，期間逐日檢測一組，計數，最後把7天中的細胞數值繪成圖，即為細胞生長曲線。
標準的細胞生長曲線類似微生物生長曲線，近似「S」形，一般在傳代後第一天細胞數有所減少，經過一段時間的潛伏期，再進入對數生長期，達到平台期和生長穩定，最後衰老。
而在這個時期進行試驗的原因有三：
1 得到足夠數量的細胞。
2 得到性質（起碼是生長能力）穩定統一的細胞，便於比較實驗結果。
3 得到健康代謝活動旺盛的細胞 （除非是研究細胞自然衰老的課題則另作打算）

⑺ 如何對數生長期

當微生物在一個密閉系統培養時，根據微生物的生長速度和比生長速度的變化情況，將微生物的生長分為不同的階段。當微生物生長一定階段後，微生物的比生長速度達到最大，此時進入對數生長期。在對數生長期中若沒有抑制或限制微生物生長的因素存在，微生物將保持一個恆定的最大的比生長速度生長，細胞數量呈指數遞增。

⑻ 細胞培養幾天能到對數期

正常情況下：真核細胞大概2-3天就到了對數期，原核細胞大概4小時就到了對數期

⑼ 細胞傳代後一般多久進入對數生長期

細胞懸浮培養生長的各個時期大體為：延緩期3～5天，對數生長期7～10天，直線生長期約7天，減慢期5～7天，生長25～30天後進入靜止期。