动物的细菌学检验是如何进行的

‘壹’ 细菌总数怎么检测

细菌总数检测目前国标规定的方法为平板计数法，其检验方法是：

在玻璃平皿内，接种一毫升水样或稀释水样于加热液化的营养琼脂培养基中，冷却凝固后在37°C培养24小时，培养基上的菌落数或乘以水样的稀释倍数即为细菌总数。

有的国家把培养温度定为35°C或其他温度，也有把培养时间定为48小时的。这种方法精度高，但耗时长，难以满足实际工作需要。

为了简化检测程序、缩短检测时间，国内外学者进行了大量的快速检测方法的研究，提出了阻抗检测法、Simplate TM全平器计数法、微菌落技术、纸片法等检测方法，取得了一定的成果，但检测时间仍在4 h以上。

本研究在分析了已有研究成果的基础上，提出了在滤膜上染色后，直接计数的细菌总数检测方法，具体步骤为：

用集菌仪进行细菌收集→在膜上进行染色→在油镜下计数→按公式计算出菌液浓度。实验结果表明，该方法与传统的平板培养法无显着性差异，检测时间约1 h，是一种快速的细菌总数检测方法。

(1)动物的细菌学检验是如何进行的扩展阅读：

水中通常存在的细菌大致可分为三类：

1、天然水中存在的细菌。普通的是荧光假单孢杆菌、绿脓杆菌，一般认为这类细菌对健康人体是非致病的。

2、土壤细菌。当洪水时期或大雨后地表水中较多。它们在水中生存的时间不长，在水处理过程中容易被去除。腐蚀水管的铁细菌和硫细菌也属此类。

3、肠道细菌。它们生存在温血动物的肠道中，故粪便中大量存在。水体中发现这类细菌，可以认为已受到粪便的污染。致病性肠道细菌有沙门氏杆菌（伤寒和副伤寒菌）、B型炭疽菌、痢疾志贺氏菌和霍乱弧菌等。

‘贰’ 如何进行动物圈舍消毒质量的微生物学检查

可以随机选取几个位置，用棉签沾上无菌水擦拭，然后涂抹平板培养，检测菌落生长情况。

‘叁’ 归纳概括细菌检验方法

10种常用的细菌检测方法

一、[3H]脱氧胸苷摄入法测定细胞数：
1、用RPMI-1640培养液洗涤对数生长期（培养3天）的CTLL-2细胞两次，每次250×g离心10分钟，洗去培养液中残存的IL-2。
2、用台盼蓝（1% Trypan blue）染色法计数细胞并决定细胞的活力，用10%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞至1×105/ml。
3、在96孔细胞培养板中每孔加0.1ml倍比稀释的标准IL-2或待测样品，每个稀释度三个复孔，标准IL-2从40 IU/ml稀释到0.019 IU/ml（8～10个稀释度），阴性对照孔不加IL-2。
4、每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养18～24小时。每孔加10μl（0.5μCi或1.85×104Bq）[3H]脱氧胸苷，继续培养4小时。
5、用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用3%醋酸水溶液滤纸3次，洗去游离的[3H]TdR。将滤纸置液体闪烁瓶中，加入5ml闪烁液。在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活性（每分钟放射性计数，cpm），根据仪器效率换算成dpm（每分钟衰变数）。
6、用dpm值对样品稀释倍数作图。在图上，标准IL-2的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的S型，说明是同样的分子反应。比较同样dpm处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。
二、MTT检测法：
1、取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）
2、用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。
3、吸去培养液，用PBS洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。
4、每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。
5、每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10% SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
三、XTT检测法：
用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤，XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan）。代谢产物在OD450处有吸收峰。
四、MTS检测法：
1、培养IL-2依赖细胞株CTLL-2细胞或HT-2细胞（检测IL-2），或者IL-3依赖细胞株FDC-P1细胞或FL5.12细胞（检测IL-3）到对数生长期。
2、取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述细胞之一的DMEM培养液（加10%小牛血清）。
3、每孔加0.1ml系列稀释的待测细胞因子（IL-2或IL-3）样品或细胞因子标准品，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。
4、每孔加20μl MTS/PMS混合液，继续培养3～4小时显色。
5、检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm（或490nm，或570nm和690nm）处检测各孔的光吸收值（OD）。用样品稀释度对OD值（OD570、OD490或OD570/OD690）绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。
五、NAG检测法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。
2、吸去培养液，用PBS洗涤两次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前先离心）。
3、每孔加60μl NAG染液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。
4、每孔加90μl终止液，混匀后置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长402nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
六、AlamarBlueTM摄入法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。
2、在培养结束前24小时加入Alamar Blue染料，96孔细胞培养板每孔20μl。
3、在培养结束后，直接在酶联检测仪上测定光吸收值。氧化型Alamar Blue的最大光吸收在570nm，用OD570减去OD600即为活细胞还原的Alamar Blue染料，颜色深浅与活细胞数成正比。
七、碱性磷酸酶检测法（AKP法）：
1、按MTT法用细胞因子处理靶细胞适当时间，用PBS洗去死亡细胞，洗两次。
2、向96孔细胞培养板各孔中加0.2ml新鲜配制的底物液（0.2mol/L 硼酸，1mmol/L MgCl2，1.2mmol/L甲伞基磷酸）。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养3小时。
3、在荧光计数仪上测定荧光的量。根据测定已知不同数目细胞的荧光量作出标准曲线，根据标准曲线可得到各孔中的活细胞数。
八、三磷酸腺苷检测法（ATP法）：
1、ATP反应液（Bio-Orbit）是粉末状混合物，含有荧光素、荧光素酶、0.5mmol醋酸镁、50mg BSA和0.1μmol无机焦磷酸。在4℃可以保存1个月。用前用10ml含2mmol/L EDTA的0.1mol/L pH7.75 Tris-醋酸缓冲液稀释。稀释液分装后可在－20℃长期保存。
2、在已经完成促增殖或抑生长试验后的96孔细胞培养板中（每孔含100μL细胞培养液），每孔加0.1ml ATP释放因子，室温中反应5分钟。取另一块96孔细胞培养板，从第一块板的各孔中吸0.1ml细胞溶解物到第二块板的相应各孔。
3、在低于25℃中，将第二块板置自动多孔荧光检测仪中。用自动加样器，每孔加入20μl ATP反应液，立即检测10秒钟的荧光强度。温度升高，检测敏感性就下降。
4、用RLU（Y轴）对细胞因子标准品的稀释度（X轴）作标准曲线，根据标准曲线确定待测样品中细胞因子的含量。
九、染料染色法测定细胞数：
1）结晶紫检测法：
1、在96孔细胞培养板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养2～3小时，让细胞帖壁。
2、用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个，3个阳性对照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18～24小时。
3、甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.1ml 10%甲醇溶液固定细胞30秒钟。
4、吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml结晶紫染液，室温中放置20分钟。
5、轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。
6、测定前，每孔加0.1ml 33%醋酸脱色，充分振荡后在570nm处测定光吸收度。用光吸收度（OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性
2）NBB检测法：
1、在用细胞因子处理靶细胞以后倾去培养液，倒置培养板于吸水纸上吸干培养液。再用100μl磷酸缓冲盐水小心洗去死细胞，用吸水纸吸干培养液。
2、每孔加100μl NBB染液，室温中染色30分钟。轻轻染液。用吸水纸吸干染液。</P< p>
3、每孔加100μl福尔马林固定液固定15分钟。用自来水轻轻洗去固定液，倒置培养板，用吸水纸吸干染液。
4、每孔加150μl 50mmol/L氢氧化钠。轻轻振荡培养板直到染料全部溶解并均匀分布。在分光光度计上读取各孔在620nm处的光密度（OD）值。计算TNF的活性。
3）美蓝染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μL细胞培养液的检测孔中，每孔加0.02ml 25%戊二醛固定活细胞15分钟，用自来水缓缓洗去死细胞和固定液。
2、每孔加0.1ml 0.05%美蓝染液，染色20分钟，用自来水缓缓冲净染液，晾干。
3、每孔加0.2ml 0.33mol/L盐酸溶解美蓝，振荡混匀。在665nm波长处测定光吸收度。计算TNF的活性。
4）中性红染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μL细胞培养液的检测孔中，每孔加50μl 5%中性红染液。继续培养2小时。
2、小心倒去培养液。用200μl Hanks液洗涤细胞1次。小心倒去培养液，减少细胞丢失。
3、每孔加100μl脱色液，在摇床中轻轻摇晃溶解30分钟。在550nm波长处测定OD值。
十、直接计数细胞：
1、如果靶细胞是帖壁细胞，在细胞因子作用适当时间后，用生理盐水洗去死亡细胞，用0.25%胰蛋白酶液消化细胞。加适量生理盐水吹打，使细胞分散成单个细胞。直接在血细胞计数板上计数细胞。
2、如果靶细胞是悬浮细胞，则需要用染色剂区分死细胞和活细胞然后再计数。通常用台盼蓝染色细胞，活细胞可以排除进入细胞的台盼蓝而不着染，死细胞着染呈深蓝色。
3、计数血细胞计数板上4个大方格中的全部活细胞，按下式计算活细胞数：活细胞数（个/ml）＝计数的全部活细胞数×10 000×2×1/4。

‘肆’ 细菌检测最简单的方法

一.使用细菌总数测试片,只需要购买细菌总数测试片,再按要求使用,有说明书.
二.红细胞计数法
首先要了解这个方法的原理.把N个红细胞与细菌均匀混合,再数出一小块区域内的红细胞数n和细菌数m.因为细胞已经均均匀混合,所以,局部的细胞数比和整体的细胞数比是接近相同的.即 n/m=N/M (n为局部红细胞数,N为总红细胞数,m为局部细菌数,M为总细菌数）n,m已数出.N又已知.所以总细菌数N就可以算出来.再取几个局部,算平均值,就能得到较精确的细菌数目.
如果这样做,只要数出一小块区域内的细菌数就可以知道总细菌数.如果不加红细胞,一个一个数,用要数到何年何月啊!细菌可是对数增长.加入红细胞的作用就像比例尺一样,地图上总有1：XXX的比例尺,你在显微镜的一个是视野里看到的红细胞数目就像地图上你测得的距离,数清一个是视野的菌数后,乘以相应分散度就可以了,分散度时用红细胞算的,具体的教材上应该有.不用也可以,不过要换成相应大小别的东西代替,总之用光学显微镜差菌数,这是不可缺少的.
这里运用了样方法,就是在若干样方中计数全部个体,然后将其平均数推广,来估计种群总体数量的方法.样方法相关知识：
①样 方：样方也叫样本,从研究对象的总体中抽取出来的部分个体的集合,叫做样方.
②随机取样：在抽样时如果总体中每一个个体被抽选的机会均等,且每一个个体被选与其他个体间无任何牵连,那么,这种既满足随机性,又满足独立性的抽样,就叫做随机取样(或叫做简单随机取样).随机取样不允许掺入任何主观性,否则,就难以避免调查人员想获得调查属性的心理作用,往往使调查结果偏大.
③适用范围：植物种群密度,昆虫卵的密度 ,蚜虫、跳蝻的密度,细菌数量测量等.
样方法取样方法
①点状取样法点状取样法中常用的为五点取样法,如图A,当调查的总体为非长条形时,可用此法取样.在总体中按梅花形取5个样方,每个样方的长和宽要求一致.这种方法适用于调查植物个体分布比较均匀的情况.
②等距取样法当调查的总体为长条形时,可用等距取样法,如图B,先将调查总体分成若干等份,由抽样比率决定距离或间隔,然后按这一相等的距离或间隔抽取样方的方法,叫做等距取样法.例如,长条形的总体为100 m长,如果要等距抽取10样方,那么抽样的比率为1/10,抽样距离为10 m,然后可再按需要在每10 m的前1 m内进行取样,样方大小要求一致.
样方法的两种边角统计方式如下图（红色为需统计边线）
样方法具体步骤如下：
①确定调查对象；
②选取样方：必须选择一个该种群分布较均匀的地块,使其具良好的代表性；
③计数：计数每个样方内该种群数量；
样方法的两种边角统计方式
④计算：取各样方平均数.

‘伍’ 如何进行畜禽舍消毒质量的微生物学检查

消毒的目的是杀灭环境中的病原微生物，首先应将场地和物品的污物清除清洗干净，然后再进行消毒。
常用的消毒剂 有以下几种：
1．氢氧化钠（苛性钠、烧碱）：常用1%－2%浓度，用于环境及物品消毒，也可用于消毒坑。对金属有腐蚀性。
2．福尔马林：含37%－40%甲醛溶液，有较强的杀菌、杀病毒作用，与高锰酸钾作用常用于熏蒸消毒，也可用0.5%－1%溶液作喷洒消毒。
3．新洁尔灭：0.1%浓度用于饲养人员手的消毒，手术器械器具消毒浸泡30分钟。用于粪便、污水消毒效果不好，新洁尔灭遇肥皂则作用消失。
4．酒精（乙醇）：消毒用70%浓度，主要用于消毒饲养人员手及皮肤。
5．碘酒（碘酊）：3%－5%碘酒用于注射部位、手术部位消毒。
6．过氧乙酸：对细菌病毒均有效，0.3%－0.5%溶液可用于各种消毒。现配现用。
7．除菌净：含氧化剂，对细菌病毒有效。
8．高锰酸钾：强氧化剂，0.05%－0.1%溶液可用于饮水消毒。
9．煤酚皂溶液（来苏儿）：1%－2%溶液可用于消毒饲养人员手、器械，5%溶液消毒禽舍、场地。
10．生石灰（氧化钙）：遇水生成氢氧化钙起消毒作用。10%－20%石灰乳可用于涂刷墙壁、消毒地面。石灰乳要现用现配。
（二）消毒方法
1．阳光消毒：太阳光谱中的紫外线有较强的杀菌作用，笼具等物品清洗后在阳光下曝晒可达到消毒的目的。
2．紫外线消毒：鸡场的大门、人行通道可安装紫外线灯消毒，工作服、鞋、帽也可用紫外线灯照射消毒。紫外线对人的眼睛有损害，要注意保护。
3．火焰消毒：对金属笼具、地面、墙面可用喷灯进行火焰消毒；对鸡舍垫料、病鸡死尸可进行焚烧处理。
4．煮沸消毒：是一种简单可*的消毒方法。金属器械、玻璃用具、工作服等可在锅内煮沸消毒。
5．熏蒸消毒：密闭的房舍，孵化器等可用熏蒸消毒法。常用福尔马林气体熏蒸，一般近每立方米空间用富尔马林25毫升，加入高锰酸钾12.5克产生福尔马林气体。过氧乙酸亦可用于熏蒸，按每立方米空间用1－3克纯品，配成3%－5%溶液，加热产生气体熏蒸。
6．喷洒消毒：对鸡舍、场地、环境一般采用规定浓度的化学消毒剂进行喷洒消毒。喷洒消毒之前应把污物清除干净，因为有机物特别是蛋白质的存在，能减弱消毒药的作用。
7．生物热消毒：利用粪便垫料发酵产生的热杀死病原体，可达到消毒目的。将粪便污物装入发酵池，装满后密封3个月可作肥料使用。
8．带鸡消毒：在鸡舍喷雾消毒鸡体，炎热季节还可起到防暑降温作用。
进鸡前鸡舍笼具的消毒
鸡舍、饲料房、笼具、垫料在进鸡前1－2周都必须严格做好清洗消毒的准备工作。
1．消毒器械
喷雾器：有背携式手压喷雾器，背携式机动喷雾器，担架式机动喷雾器，根据具体情况选用。喷雾用的消毒液应先配制溶解后再过滤装入喷雾器中，以免残渣堵塞喷嘴，影响消毒工作。喷雾器用完后应清洗干净，经常维修保养，以延长使用期限。 火焰喷灯：是利用汽油或煤油做原料的一种工业用喷灯，喷出的火焰温度很高，常用来消毒金属笼、食槽、饮水槽。消毒时在某一点不要停留时间过长，以免将物品烧坏。消毒时要有次序，以免发生遗漏。
2．禽舍及笼具的消毒
首先将禽舍内的粪便污物消除干净，用水（最好高压水）彻底将禽舍、笼具、食槽、水槽、门窗冲洗干净，晾干后用火焰喷灯将笼具、食槽、水槽火焰消毒一次，再用消毒液如0.5%过氧乙酸或0.5%百毒杀喷洒消毒。地面用2%－5%烧碱消毒。鸡舍、工作服、用具用福尔马林熏蒸，按每立方米空间用福尔马林25毫升高锰酸钾12.5克用量，先将高锰酸钾放入器皿中，再加福尔马林，用木棒搅拌，待到刺鼻气体发出时，迅即离开鸡舍，关闭门窗，不得少于2小时，进鸡前2－3天将门窗打开，让空气对流，待鸡舍内无刺鼻气味方可进鸡。

‘陆’ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

1、快速测试片技术法

快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。

2、生物电化学方法

生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。

常见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。

3、微菌落技术

微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 20 世纪50年代，定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始，国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。

4、气相色谱法

气相色谱应用到微生物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

5、高效液相色谱法

利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

‘柒’ 当家兔发生细菌病时，进行细菌学检验的项目包括哪些

（1）细菌形态学检验

观察细菌形态通常需将细菌或含有细菌的血液、组织等制成玻片标本，经固定、染色后镜检。染色的方法可分为单染法（如美蓝染色）、鉴别染色法（如革兰氏染色、抗酸染色）、特殊染色法（如芽孢染色、鞭毛染色）和血片、组织片的染色法（如姬姆萨染色、瑞氏染色）等。

（2）细菌的分离与培养。

（3）药敏试验

测定致病细菌对药物的敏感程度，有助于临诊上选用合适的药物进行治疗。在采用中草药治疗疾病时，亦可用药敏试验来测定中草药的抗菌性能。

药敏试验最常用的是纸片法，所需纸片可向有关单位购买，亦可自行配制。

‘捌’ 什么是细菌学检验

细菌学是微生物学的一个分支学科。它主要研究细菌的形态、生理、生物化学、生态、遗传、进化、分类及其应用的科学。

研究对象
空气中也存在着人和动物的病原菌，能引起各种疾病。为了排除杂菌，巴斯德于1886年创造了巴氏消毒法。1877年，英国化学家廷德尔建立了间歇灭菌法或称廷氏灭菌法。1876年创立了无菌外科。同年，德国人科赫分离出了炭疽菌，提出有名的科赫法则。他为了弄清霍乱弧菌与形态上无法区别的其他弧菌的不同，进行了生理、生物化学方面的研究，使医学细菌学得到率先发展。
1880年前后，巴斯德研究出鸡霍乱、炭疽、猪丹毒的菌苗，奠定了免疫学的基础。科赫首先采用平板法得到炭疽菌的单个菌落，肯定了细菌的形态和功能是比较恒定的。自从单形性学说取得初步胜利之后，就建立了以形态大小为基础的细菌分类体系，随后又用生理、生物化学特性作为分类的依据，使细菌分类学的内容逐步得到充实。
十九世纪的最后20年，细菌学的发展超越出了医学细菌学的范畴,工业细菌学,农业细菌学也迅速建立和发展起来。1885～1890年，维诺格拉茨基配成纯无机培养基，用硅胶平板分离出自养菌(硝化细菌、硫化细菌等)，还研制了一种“丰富培养法”，能比较容易地把需要的细菌从自然环境中选择出来。