动物细胞传代的步骤有哪些

1. 动物细胞培养中如何保证在传代过程中不被微生物污染

首先，器具应做无菌处理，通常要在培养液中添加一些抗生素，可防止污染，应定期更换培养液，以便清除代谢产物，防止其积累对细胞自身造成伤害。另外，要从实验步骤抓起，如下：
1．人无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。

2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。3．超净台台面应整洁，用0.1%新洁尔灭溶液擦净。

4．打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。

5．点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。

6．将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

2. 动物细胞的基本过程

取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将材料剪碎，并用胰蛋白酶处理（消化），处理形成单个细胞，将单个的细胞放入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液；悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。再配成一定浓度的细胞悬浮液。另外，我们将培养10代以内的培养称为原代培养。10代以后的称为传代培养。培养10~50代的细胞称为细胞株。当培养超过50代时，大多数的细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变出现了无限传代的特性，即癌变。此时的细胞被称为细胞系。

3. 动物细胞培养的一般步骤是什么

一、复苏
1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5.3天换一次培养基。
二、传代
1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2.把原有培养基吸掉。
3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。
4.细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。
5.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
6.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。
三、 冻存
把细胞消化下来并离心（同上）。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
冻存液的配制： 70%的完全培养基 20񳀐%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

要注意的就是无菌操作！

4. 动物细胞培养过过程

1、取动物组织块剪碎
2、用胰蛋白酶处理分散成单个细胞
3、制成细胞悬液
4、转入培养液中进行原代培养
5、贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶分散为单个细胞制成细胞悬液
6、分瓶转入培养液进行传代培养

5. 谁有细胞传代培养具体的操作步骤和注意事项

悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代

贴壁细胞实验需准备超净台喷洒酒精，紫外照射30min。准备好培养瓶/皿，离心管，10%DMEM，0.25%胰酶，D-hanks液等，带上手套，口罩等，倒去旧培养基，用D-hanks液清洗一遍，去除沉积的死细胞等。

加入2ml 0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。加入1～2滴管含有血清的培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。

以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。

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注意事项

1、传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

2、每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

3、如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。

6. 动物细胞培养的基本过程

一、准备工作

准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。

二、取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。

取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。

三、培养

将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。

正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。

细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。

四、冻存及复苏

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。

在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

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进入细胞间开始细胞培养时，注意事项：

①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。

②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。

③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。

④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始前可以把所有瓶盖旋松。

⑤尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。

⑥操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。

⑦实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。

7. 动物细胞培养中的细胞株和细胞系以及原代培养和传代培养该如何简单的理解死抄概念者不理！用自己的话解

动物细胞培养,大致的步骤是这样:
1.从动物胚胎或者一些刚出生的动物的器官或者组织上取得细胞,配制成细胞悬浮液.把细胞液放到培养瓶中,在培养箱里培养--------原代培养.

2.但是,不要以为这样就能一直无限培养下去.

因为细胞在那个瓶壁上生长的时候,如果大量增殖,细胞之间会彼此相碰,细胞细胞就会停止分裂增殖，出现一种接触抑制.

我们为了它们能继续增殖,就用胰蛋白酶再把它们分开,然后再配制成细胞悬浮液,分开装到好几个瓶子里继续培养--------传代培养.

细胞株&细胞系
1.它们都是传代培养里面的概念.都是10代以后的

2.细胞株是传代培养里10~50代,细胞系是50代以后的;

3.对于细胞繁殖而言,传到10代就很不容易了,所以细胞株是极少数的细胞

4.50代以后,细胞繁殖会出现另一个危机,基本上没有什么细胞能再传下去了.但是,有细胞发生了基因突变,像一个癌细胞一样无限地分裂下去,这就是细胞系.

8. 传代细胞的培养步骤

1、附着型胞(adherentcell)

（1）吸掉旧培养液。

（2）用D-PBS洗涤细胞一至二次。

（3）加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液。

（4）轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

2、悬浮型细胞(suspensioncell)

（1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。

（2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

3、融合瘤(hybridoma)

有些hybridomacell需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。

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传代方法：

1、悬浮生长细胞传代

多采用离心法传代。1000转/分,20-30秒后去上清。沉淀细胞加新培养液后再混匀传代。亦有直接传代 法，即悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2-1/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代.

2、半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）

此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。

3、贴壁生长细胞传代

采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

9. 细胞培养的一代生长过程如何

一代贴附生长细胞的生长过程
“-代”指的是从细胞接种到下一-次再传代接种的一段时间
潜伏期(缓慢)
游离期:细胞接种后在培养液中呈悬浮状态,此时胞体呈圆球形。一般10分钟一4小时。
贴壁期:贴附并逐渐伸展- -般24小时内贴壁。
潜伏期;此时细胞有生长活动,而无细胞分裂。细胞株潜伏期-般为6 ~ 24小时。
指数生长期(增殖迅速)
细胞数随时间变化星指数增长,活力最佳,最适合进行实验研究

停滞期(生长停止):

细胞数量达到饱和密度,细胞就停止增殖。

10. 细胞工程的步骤是怎么样的

植物细胞培养的基本过程主要包括的步骤：（1）从健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、花、果实、花粉等，选择用于培养的起始材料，（2）用一定的化学药剂（最常用的有次氯酸钠、升汞和酒精等）对外植体表面消毒，建立无菌培养体系。这是获得培养成功的重要一步。（3）形成愈伤组织和器官，外植体块在培养基上形成疏松的愈伤组织，由愈伤组织分化出芽并可进一步诱导形成小植株。另一途径是用外植体或愈伤组织细胞经液体悬浮培养诱导胚壮体再长成植株。胚壮体的形成可大大提高繁殖效率，并可减少变异
动物细胞培养的主要步骤：（1）在无菌条件下，从健康动物体内取出适量组织，剪切成小薄片；（2）加入适宜浓度的酶与辅助物质进行消化作用使细胞分散；（3）将分散的细胞进行洗涤并纯化后，以适宜的浓度加在培养基中，于37°C下培养，并适时进行传代。