① 人和小白鼠都是哺乳动物，胰高血糖素对小白鼠和人具有相同的生理作用．为了验证胰高血糖素具有升高血糖
二、方法步骤第一步，实验设计要遵循对照原则和单一变量原则，所以该实验要求设计两组实验，一组小白鼠为实验鼠，腹腔注射胰高血糖素溶液；另一组小白鼠为对照鼠，腹腔注射等量的生理盐水．三、实验结果的预测、分析和结论 （1）1试管内出现砖红色沉淀，说明实验鼠尿液中含有葡萄糖；2试管内溶液仍为蓝色（斐林试剂的颜...色），说明对照鼠尿液中无葡萄糖． （2）实验结论：实验鼠血糖升高，超过一定数值后会出现糖尿，这是由于胰高血糖素具有升高血糖的生理作用．故答案为：二、方法步骤第一步，胰高血糖素溶液; ;; 等量的生理盐水三、实验结果的预测、分析和结论（1）1试管内出现砖红色沉淀，说明实验鼠尿液中含有葡萄糖；2试管内溶液仍为蓝色，说明对照鼠尿液中无葡萄糖（注：试管内的尿液来源要与颜色反应相对应）（2）实验鼠血糖含量升高，超过一定数值而出现糖尿，这是由于胰高血糖素具有升高血糖含量的生理作用所引起的
② 酶作为生物催化剂，不仅具有一般无机催化剂的特点，还具有专一性、高效性和温和性等特点，请用所给的实验
（1）该题是要验证蔗糖酶和淀粉酶的催化作用具有专一性，通过实验目的和实验材料分析出实验是自变量是底物不同、酶种类不同，因变量是否出现砖红色沉淀，其他属于无关变量，实验的分组应分四组，实验设计应遵循对照性原则、科学性原则和单一变量原则．
因此表格中所填内容如下；
| 溶液 试管 | 蔗糖溶液 | 淀粉溶液 | 蔗糖酶溶液 | 唾液淀粉酶溶液 |
| 甲 | + | - | + | - |
| 乙 | + | - | - | + |
| 丙 | - | + | + | - |
| 丁 | - | + | - | + |
| 溶液 试管 | 蔗糖溶液 | 淀粉溶液 | 蔗糖酶溶液 | 唾液淀粉酶溶液 |
| 甲 | + | - | + | - |
| 乙 | + | - | - | + |
| 丙 | - | + | + | - |
| 丁 | - | + | - | + |
③ 毒理学试验方法有哪些
现代毒理学的研究方法，由于其本身包括众多的分支学科，分别在相应的学科领域里建立了自己的研究方法，现归纳为两大类。(一)实验研究(微观研究)动物实验的方法仍是现代毒理学实验的重要方法之一，传统的毒理学通过整体动物实验已为人类提供了大量的以剂量-效应(反应)为主的数据库，结合人群接触水平对许多化学物质进行了安全性(危险度)评价。
由于外源物的数量巨大，整体动物实验需要消耗大量的时间和经费，也不能满足数以万计的外源化学物质的毒性评价要求，另一方面为了保护动物，尽量减少动物的使用，所以由过去以整体动物试验占主导地位的观念，转向以体外试验为主导地位的趋势。但也需指出，体外试验的发展并不排斥整体实验的重要性，两者相互补充，互为验证才能为科学研究提供可靠数据，随着生命科学的发展，分子生物学的理论及技术被引入现代毒理学，近年来在分子水平上建立了许多新方法。
1．体内试验
哺乳动物体内试验，也称整体动物实验，一般包括：急性毒性试验、亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验及慢性毒性试验。还有特殊毒性实验，如哺乳动物致突变试验、致畸试验、致癌试验。以上试验在毒理学中统称“三性”和“三致”试验。
常用的试验动物：大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、家兔、狗、猴等。检测环境污染物的毒性试验，常选用鱼、蚤类或其他水生生物。还可用鸟类、昆虫进行试验。
近年来为了从分子水平探讨致突、致癌机制，转基因动物已开始在毒理学试验中应用。
转基因动物是一种集整体水平、细胞水平和分子水平于一体的实验动物，更能体现生命整体研究的效果，它是把经典的与现代的毒理学研究方法相结合，无疑会推动现代毒理学实验研究的发展。
2．体外试验
利用游离器官、培养的细胞、细胞器以及利用微生物等进行毒性研究的方法为体外试验，此方法多用于观察外源物对生物体特殊毒性的初步筛检及作用机制和代谢转化过程的深入研究。
体内与体外试验各有优点和局限性，应根据试验目的和要求，选择一组试验，才能互相弥补优缺点。(二)人群调查(宏观研究)人群调查也称为人群毒理学，是在人群中研究外源物对人体产生毒作用的规律，为人群检测和制订预防措施提供比动物试验更直接更可靠的毒理学资料，主要包括以下3个方面：
1．中毒临床观察
常见于偶然发生的事故，如误服、自杀、毒性灾害等，通过急性中毒事故的处理和治疗，可直接观察到中毒的症状并分析可能的毒效应的靶器官。
2．志愿者试验
在不损害人体健康的原则下，有时可设计一些不损害人体健康的受控试验，仅限于低剂量、短时期的接触毒性作用可逆的化学品，目前国际上提倡健康志愿者的毒性试验，减少由动物试验结果外推于入的不确定性，特别是一些神经毒物出现的毒性效应，如头晕、目眩、复视等需要表达的中毒症状，只有人才能真实地反映出来，所以国外健康志愿者的毒理学研究资料倍受重视。
3．流行病学调查
将动物试验的结果，进一步在人群调查中验证，可以从人群的直接观察中，取得动物试验所不能获得的资料，优点是接触条件真实，观察对象是一个大的群体，为人群检测和防治措施提供比动物试验更直接、更可靠的科学资料，但是也存在许多难点：①人群中观察外源物的毒性效应大多数为慢性毒性效应，特别是人类致癌物质其致癌效应所需时间过长；②接触人群中所用的观察指标是非特异性的，与对照人群比较需要足够例数：③外环境因素混杂，外源物的种类繁多而且多种化学物质可出现联合作用，难以确定某种特定的化学物质毒性效应和其因果关系。
近年来由于分子生物学的发展和渗透，在传统流行病学调查方法中引进了细胞、分子水平的人群检测方法，如生物标志物作为癌症早期判断的信息，把分子生物学与流行病学结合为一体发展为分子流行病学。这门新兴学科利用分子生物学、分子遗传学、生物化学、免疫学等手段研究，评价不同人群或个体致癌危险度及其机制，从而使现代毒理学由实验动物研究发展到人群和个体易感性研究的新阶段。
它可以解答人体从接触化学物质到发生疾病的过程中所发生的一系列连续性的变化，从中提取更多的癌前病变的信息，为癌症的早期判断、早期防治提供科学依据。可以预测，分子流行病学在21世纪将会得到更大的发展。
综上所述，正确的方法是将宏观研究与微观研究有机地结合起来，宏观研究为微观研究提供线索，微观研究为宏观研究提供依据，两者结合起来才能对外源化学物质作出准确的危险度评价。
④ 哺乳动物细胞蛋白表达纯化服务实验报告案例
本案例基于pAZV5分泌表达体系，使用基因合成的方法构建pAZV5表达载体，瞬时转染HEK293悬浮细胞，通过SDS-PAGE和 Western Blot检测蛋白的表达情况，扩大培养收集细胞上清并通过Ni柱的亲和纯化获得目的蛋白。
一、实验设计
我们分析客户提供的Target-Gene序列，整个蛋白序列呈亲水性，自身不带信号肽序列，因此我们设计思路为：
1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板，通过密码子优化一套最适宜HEK293细胞系的基因序列。
1.2、推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pAZ-V5载体来进行实验，利用载体自带的V5信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外，为了保持蛋白的N端活性，我们在C端添加6XHis-Tag便于重组蛋白的检测和亲和纯化。
依据上述设计思路，以基因合成的方式构建pAZ-V5表达质粒，经过测序和酶切验证无误后，挑取无内毒素的质粒。转染200ml HEK293细胞，通过western blot检测蛋白表达情况，确认蛋白表达情况，再通过Ni-resin亲和纯化获得80%以上目的蛋白。
二、试剂和耗材
名称 公司 名称 公司
DMEM 高糖、DMEM低糖、胎牛血清、胰蛋白酶、opti SFM、转染试剂Invitrogen（Gibco）无内毒素质粒中提试剂盒、LAL内毒素检测试剂、基础化学试剂、低熔点琼脂糖Sigma公司
抽提试剂盒Axygen公司PCR试剂盒IO-RAD公司
六孔板、细胞培养瓶、离心管corning公司PCR反应管Fisher公司
DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒AXYGEN公司Agarose上海基因公司
中性红碧云天生物公司其它试剂均为国产分析纯
二、主要实验仪器
仪器名称 公司 仪器名称 公司 仪器名称 公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机美国BECKMAN公司台式高速离心机德国SORVAL公司Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统美国BIO-RAD公司
PTC-200基因扩增仪美国MJ Research公司320-S pH计美国Mettler Toledo公司AR5120电子天平美国AHOM S公司
MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪美国Amersham Pharmacia公司雪花状制冰机日本SANYO公司JY92-2D超声波细胞粉碎机中国新芝科器研究所
蛋白核酸检测仪南京大学普阳科学仪器厂NANODROP2000美国Thermo公司超净工作台中国苏净集团
四、蛋白性质分析
4.1 客户提供原始基因序列
GTGGGGTGCT******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容，不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******CTTCTCCCTT
4.2 编码的蛋白序列如下（理论分子量41.18KD，理论等电点PI6.73）
GCSVDFSK******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容，不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******TAGSTDHMDHFSL
4.3 稀有密码子序列分析如下图所示（红色：使用频率低于10% 灰色：使用频率低于20%，绿色为正常频率密码子）
4.4 蛋白序列跨膜及亲疏水性分析
4.5 信号肽预测
综上所述：
1、蛋白理论分子量为 41KD，属于正常分子量范围，较适宜表达。
2、通过对基因密码子使用频率的分析，如果以293细胞为表达宿主，基因序列上使用频率低于20%的密码子X个，使用频率低于10%的密码子X个，优化后通过基因合成方式获得目的基因。
3、通过对蛋白的跨膜结构和亲疏水性分析，蛋白整体呈亲水性，但从473AA之后，蛋白存在典型的跨膜结构，建议去除后表达以提高成功率。
4、目的蛋白自身无信号肽，添加GP67信号肽便于蛋白分泌表达。为了纯化方便，考虑在C端添加His标签。
五、实验方法及实验结果
5.1 pAZ-V5表达质粒构建
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因，双酶切连接至pAZ-V5载体的Afl II和Xba I之间；将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如下所示，单划线区为目的基因基因区域。紫色区域为酶切位点，黄色区域为v5信号肽，绿色区域为6XHis标签；
T A G C A G A G C T C T C T G G C T A C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C T G G C T T A T C G A A A T T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G A G A C C C A A G C T G G C T A G C G T T T A A A C T T A A G C * * X 3 * * * * N N N N N N---略-----N N N N N N * * T G A G T A G G C A C C A C C A C C A C C A C C A C T G A C T C T A G A G G
5.2 使用Chromas软件查看测序峰图文件，截取部分序列示例如下：
5.3 pAZ-V5载体图如下所示：
表达条件优化
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⑤ DNA染色实验中用哺乳动物或人的成熟红细胞进行,会出现什么结果
DNA染色实验是利用DNA与甲基绿的结合性，呈现绿色，而哺乳动物或人的成熟红细胞已高度特化，没有细胞核和细胞器，也就没有DNA，所以不会呈现绿色。
⑥ 如何验证一段在哺乳动物不存在的序列
如何验证一段在哺乳动物不存在的序列
有SV40病毒表达载体、痘病毒表达载体、逆转录病毒表达载体，常见的哺乳动物表达载体的组成成分有：原核DNA序列、启动子、增强子、拼接 信号、终止信号和多聚腺苷酸化信号、筛选标记及真核病毒序列等。
(1)原核DNA序列： 为了能在大肠杆菌中增殖，得到大量能转染哺乳动物细胞的重组DNA，不哺乳动物表达载体中通常有一段原核序列，包括一个能在大肠杆菌中自身复制的复制子， 便于挑选含重组DNA细菌的抗生素抗性基因，以及便于把真核序列插入载体的少数单一限制性酶切位点。当具 备这些序列以后，外源的真核基因序列可由单一酶切位点插入载体中，形成的重组DNA可在大肠杆菌中增殖，经抗生素筛选后进行DNA提取，即可得到大量的所需的哺乳动物细胞表达载体。
(2)启动子： 真核生物的启动子区域位于TATA区上游100bpd到230bp之间，TAT区位于转录起始点上游25-30bp处。启动 子的转录销路因细胞而异。因此需根据宿主细胞类型选择不同的启动子。
(3)增强子： 增强子是使启动子的基因转录效率显着提高的一类顺式作用元件，有多个独立核苷酸序列组成。它们的作用通常不具有方向性，在位于转录起始点的下游或离启动子很远是仍有活性。许多增强子只 能在特定的组织或细胞中起作用，即具有组织细胞的特异性，因此在构建真核表达载体的时候，应根据宿主细胞来选择增强子。
(4)剪接信号： 真核基因由许多内含子和外显子组成。被转录成mRNA前体以后，需通过剪除内含子、连接外显子才能成为成熟的mRNA。一 般mRNA拼接需要的基本序列位于内含子的5’和3’末端，因此，改变拼接位点5’和3’末端两侧的外显子序列可能回影响邻近拼接位点的使用效率，在替换 外显子是应注意。
(5)终止信号和多聚腺苷化的信号： 转录的终止信号常常位于多聚腺苷化位点下游的一端长度为几百个核苷酸碱基的DNA区域内。多聚腺苷化需要两种序列：位于腺苷化位点下游的GU丰富区或U丰富区和 位于腺苷化位点上游11-30个核苷酸处的一个有6个核苷酸碱基组成并高度保守的AAUAAA序列。为了保证目的mRNA能有效地多聚腺苷化，真核表达载体上必须包括多聚腺苷化下游的一端序列。最常用的方法是用SV40的一端237bp长的BamHⅠ- BclI 限制性片段，含有多聚腺苷化的信号。另一种的方法是将全长 cDNA与已组装在表达载体上一个顺式作用因子的部分片段融合，提供多聚腺苷化的信号。
（6）遗传标记： 从成千上万个哺乳细胞中，检测出极少数的含DNA重组体的转染细胞，并鉴定已导入外源DNA是哺乳动物细胞基因表达系统的一个关键内容。因此，在真核生物 表达载体上必须附有标记基因，才能进行筛选。常用的标记基因有：胸苷激酶基因（thymidine kinase，TK）、二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolate rectase，DHFR）、氯霉素乙酰转移酶基因（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）、新霉素抗性基因（neomycin resistance,NEO）等。
⑦ 哺乳动物实验时需要注意哪些条件
温度：本实验控制恒定温度37度 湿度：要时刻记住用相应的润湿液润湿,本次试验用哺乳动物的台氏液 PH：要与哺乳动物体液相似 避免不必要的刺激：不要用手或者是金属触碰 离子成分与浓度：要与相关的动物体液相似,本实验是台氏液 特殊要求:神经实验时要准备隔离盒.
⑧ 验证酶的专一性，实验该怎么做
[教师准备]：查阅资料，设计合理的实验步骤，并对实验结果进行分析，总结影响实验结果的因素及其实验过程中的注意事项。精心备课，设计合理的问题，引导学生进行探究。并且为实验准备好材料用具酶的专一性探究实验：一课时。 [实验原理] 淀粉在唾液淀粉酶的催化作用下，能够水解成麦芽糖。在煮沸的条件下，斐林试剂能使麦芽糖氧化，自身还原成砖红色的氧化亚铜沉淀。因此，斐林试剂可以用来鉴定溶液中是否有麦芽糖，进而可以看出唾液淀粉酶是否只能催化淀粉水解，不能催化其他糖类（如蔗糖）水解。
[目的要求] 1．初步学会做酶的专一性实验的方法。 2．理解酶具有专一性的特点。
[材料用具]
新鲜的唾液。
消过毒的脱脂棉，镊子，试管，小烧杯，量简，玻璃棒，酒精灯，火柴。
质量浓度为3%的可溶性淀粉溶液，质量浓度为3%的蔗糖溶液，新配置的斐林试剂，清水。
[方法步骤]
1．用清水将口漱净，口内含一块消过毒的脱脂棉。用镊子取出脱脂棉，使其中的唾液收集到小烧杯中。
2．取3mL唾液，注入另一个小烧杯中，加入30mL蒸馏水，用玻璃棒搅匀，制成稀释的唾液备用。
3． 取两支洁净的试管，编号1.2，按下表加入试剂：
1号试管:3%淀粉溶液 2mL 再加稀释唾液2mL
2号试管:3%蔗糖溶液 2mL 再加稀释唾液2mL
摇匀，37℃保温5 min
4.向两支试管中加新配置的斐林试剂 2mL 摇匀，100℃保温3 min
现象: 1号试管:砖红 2号试管: 蓝色
⑨ 请用所给的实验材料和用具，设计实验来验证哺乳动物的蔗糖酶和淀粉酶的催化作用具有专一性，要求完成实验
(1) (2) ②．混匀，37℃恒温水浴一段时间 ; ③．取出试管，分别加入适量的斐林试剂，混匀，沸水水浴一段时间; ; ④．观察实验现象并记录实验结果(3)含有蔗糖和蔗糖酶溶液的试管，以及含淀粉和淀粉酶溶液的试管中出现砖红色沉淀，其他试管中不出现砖红色沉淀(4)酶的催化作用有专一性(5)20℃低于酶的最适温度，酶活性低，水解产生的还原糖少