如何设计动物实验耐药基因

‘壹’ 如何设计小分子药物作用到一个基因上

人们可以利用基因技术，生产转基因食品。例如，科学家可以把某种肉猪体内控制肉的生长的基因植入鸡体内，从而让鸡也获得快速增肥的能力。但是，转基因因为有高科技含量, 有些人怕吃了转基因食品中的外源基因后会改变人的遗传性状，比如吃了转基因猪肉会变得好动，喝了转基因牛奶后易患恋乳症等等。实际上这些担心都是不必要的，人们吃的所有食物都来自于其他生物体，几乎所有食物中都含有不计其数的带有异源基因的DNA，这些DNA分子在消化道类会被降解为单个的脱氧核糖核苷酸，才能被人体吸收用于自身遗传物质的构建。华中农业大学的张启发院士认为：“转基因技术为作物改良提供了新手段，同时也带来了潜在的风险。基因技术本身能够进行精确的分析和评估，从而有效地规避风险。对转基因技术的风险评估应以传统技术为参照。科学规范的管理可为转基因技术的利用提供安全保障。生命科学基础知识的科普和公众教育十分重要。”

军事领域
生物武器已经使用了很长的时间.细菌，毒气都令人为之色变。但是,传说中的基因武器却更加令人胆寒。

环境保护
我们可以针对一些破坏生态平衡的动植物，研制出专门的基因药物,既能高效的杀死它们，又不会对其他生物造成影响，还能节省成本。例如一直危害我国淡水区域的水葫芦，如果有一种基因产品能够高效杀灭的话，那每年就可以节省几十亿了。

科学是一把双刃剑，基因工程也不例外。我们要发挥基因工程中能造福人类的部分，抑止它的害处。

医疗方面
随着人类对基因研究的不断深入，发现许多疾病是由于基因结构与功能发生改变所引起的。科学家将不仅能发现有缺陷的基因，而且还能掌握如何进行对基因诊断、修复、治疗和预防，这是生物技术发展的前沿。这项成果将给人类的健康和生活带来不可估量的利益。所谓基因治疗是指用基因工程的技术方法，将正常的基因转入病患者的细胞中，以取代病变基因，从而表达所缺乏的产物，或者通过关闭或降低异常表达的基因等途径，达到治疗某些遗传病的目的。已发现的遗传病有6500多种，其中由单基因缺陷引起的就有约3000多种。因此，遗传病是基因治疗的主要对象。 第一例基因治疗是美国在1990年进行的。当时，两个4岁和9岁的小女孩由于体内腺苷脱氨酶缺乏而患了严重的联合免疫缺陷症。科学家对她们进行了基因治疗并取得了成功。这一开创性的工作标志着基因治疗已经从实验研究过渡到临床实验。1991年，我国首例B型血友病的基因治疗临床实验也获得了成功。

基因治疗的最新进展是即将用基因枪技术于基因治疗。其方法是将特定的DNA用改进的基因枪技术导入小鼠的肌肉、肝脏、脾、肠道和皮肤获得成功的表达。这一成功预示着人们未来可能利用基因枪传送药物到人体内的特定部位，以取代传统的接种疫苗，并用基因枪技术来治疗遗传病。

科学家们正在研究的是胎儿基因疗法。如果实验疗效得到进一步确证的话，就有可能将胎儿基因疗法扩大到其它遗传病，以防止出生患遗传病症的新生儿，从而从根本上提高后代的健康水平。

基因工程药物
基因工程药物，是重组DNA的表达产物。广义的说，凡是在药物生产过程中涉及用基因工程的，都可以成为基因工程药物。在这方面的研究具有十分诱人的前景。

基因工程药物研究的开发重点是从蛋白质类药物，如胰岛素、人生长激素、促红细胞生成素等的分子蛋白质，转移到寻找较小分子蛋白质药物。这是因为蛋白质的分子一般都比较大，不容易穿过细胞膜，因而影响其药理作用的发挥，而小分子药物在这方面就具有明显的优越性。另一方面对疾病的治疗思路也开阔了，从单纯的用药发展到用基因工程技术或基因本身作为治疗手段。

还有一个需要引起大家注意的问题，就是许多过去被征服的传染病，由于细菌产生了耐药性，又卷土重来。其中最值得引起注意的是结核病。据世界卫生组织报道，现已出现全球肺结核病危机。本来即将被消灭的结核病又死灰复燃，而且出现了多种耐药结核病。据统计，全世界现有17.22亿人感染了结核病菌，每年有900万新结核病人，约300万人死于结核病，相当于每10秒钟就有一人死于结核病。科学家还指出，在今后的一段时间里，会有数以百计的感染细菌性疾病的人将无药可治，同时病毒性疾病日益曾多，防不胜防。不过与此同时，科学家们也探索了对付的办法，他们在人体、昆虫和植物种子中找到一些小分子的抗微生物多肽，它们的分子量小于4000，仅有30多个氨基酸，具有强烈的广普杀伤病原微生物的活力，对细菌、病菌、真菌等病原微生物能产生较强的杀伤作用，有可能成为新一代的“超级抗生素”。除了用它来开发新的抗生素外，这类小分子多肽还可以在农业上用于培育抗病作物的新品种。

农作物培育
科学家们在利用基因工程技术改良农作物方面已取得重大进展，一场新的绿色革命近在眼前。这场新的绿色革命的一个显着特点就是生物技术、农业、食品和医药行业将融合到一起。

本世纪五、六十年代，由于杂交品种推广、化肥使用量增加以及灌溉面积的扩大，农作物产量成倍提高，这就是大家所说的“绿色革命”。但一些研究人员认为，这些方法已很难再使农作物产量有进一步的大幅度提高。

基因技术的突破使科学家们得以用传统育种专家难以想象的方式改良农作物。例如，基因技术可以使农作物自己释放出杀虫剂，可以使农作物种植在旱地或盐碱地上，或者生产出营养更丰富的食品。科学家们还在开发可以生产出能够防病的疫苗和食品的农作物。 基因技术也使开发农作物新品种的时间大为缩短。利用传统的育种方法，需要七、八年时间才能培育出一个新的植物品种，基因工程技术使研究人员可以将任何一种基因注入到一种植物中，从而培育出一种全新的农作物品种，时间则缩短一半。

虽然第一批基因工程农作物品种才开始上市，但美国种植的玉米、大豆和棉花中的一半将使用利用基因工程培育的种子。据估计，今后5年内，美国基因工程农产品和食品的市场规模将从的40亿美元扩大到200亿美元，20年后达到750亿美元。有的专家预计，“到下世纪初，很可能美国的每一种食品中都含有一点基因工程的成分。”

尽管还有不少人、特别是欧洲国家消费者对转基因农产品心存疑虑，但是专家们指出，利用基因工程改良农作物已势在必行。这首先是由于全球人口的压力不断增加。专家们估计，今后40年内，全球的人口将比增加一半，为此，粮食产量需增加75%。另外，人口的老龄化对医疗系统的压力不断增加，开发可以增强人体健康的食品十分必要。

加快农作物新品种的培育也是第三世界发展中国家发展生物技术的一个共同目标，我国的农业生物技术的研究与应用已经广泛开展，并已取得显着效益。

‘贰’ 动物药敏试验中药物不敏感的原因有那些

兽医临床中的药敏试验
目前由各种细菌所引起的疾病给畜禽养殖业带来严重经济损失，阻碍了养殖业的快速发展，所以使用抗菌药预防和治疗细菌性疾病成了畜禽养殖过程中的一项重要工作。但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。因此，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。
一、什么是药敏试验？
抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。药敏试验是兽医临床工作中的一项基本技能，也是使用抗菌药物治疗前必不可少的一道环节。

二、药敏试验的意义
1、可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药。因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。是一种既经济又有效的方法。
2、可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行。因为随着新型致病菌的不断出现，各种致病菌对不同的抗菌药的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药的敏感性也有差异。进行有效的药敏试验可以及时掌握各种新型菌种和菌株的耐药性，对流行病学调查建立监控，同时采取相应的措施也就可以控制和预防耐药菌株的流行。
3、为临床用药提供参考依据。因为一个正确的药敏试验结果，可作为临床兽医和畜禽养殖者选用有效抗菌药的参考。长期以来，由于各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药药效下降或消失。不能很好的掌握药物对细菌的敏感程度，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。近十几年，在肉鸡生产中，为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，一些抗菌药物的盲目使用，导致耐药菌株越来越多。根据已进行的大量药敏试验结果，大肠杆菌、沙门氏菌对曾经敏感的氨基糖苷类、氟喹诺酮类等，均产生了不同程度的耐药性，经常发现对十几种常用抗菌药都不敏感的菌株。这是一个非常危险的信号。所以在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。

三、常用的药敏试验方法
兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。其中扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。
由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数实验室和基层单位所采用。扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前牛津杯法和打孔法在兽医临床已较少应用。以下简单介绍纸片法。
1、药敏纸片的制作
纸片法中使用的药敏纸片目前市场上已有较多厂家的产品销售。但也可根据需要自制，具体自制的方法如下：
取质量较好的定性滤纸，用普通的打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或小平皿中，以单层牛皮纸扎口或包扎。经15磅15-20分钟高压灭菌后，置于37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。按每张纸片饱和吸水量为0.01ml计，在上述含有50片纸片的小瓶内加入药液0.5ml，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30分钟即可。同时在记录药物名称，于37℃温箱过夜。在温箱或烘箱中的时间不宜过长，以免某些抗生素失效。青霉素、金霉素宜在低温下真空干燥。干燥后即密封。切勿受潮，置阴暗干燥处或家用冰箱中保存，有效期4-6个月。

2、药液的制备
自制药敏纸片时还需自行配制抗菌药液。抗菌药的稀释剂通常用蒸馏水。一般可按商品药使用说明书上的配料或饮水浓度，按1g需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。如10g药物可配50kg饲料，其换算方法为：1g本品加5000ml蒸馏水。此溶液液即为用于做药敏试验的药液。

3、试验操作方法
在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。然后用无菌镊子将纸片放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。一般各纸片中心相距应大于24mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5－6片。记住每种药敏纸片的名称。贴完纸片的平皿15分钟后再置于37℃温箱中培养16－24小时，观察记录结果。以药敏纸片周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。
药敏试验结果判定标准
抑菌圈直径（毫米）敏感性
＞20极敏感
15-20高敏感
10-14中敏感
＜10低敏感
0不敏感
实践证明，利用自制药敏纸片进行药敏试验，可以灵活选药，与某病菌相关的药物均可随时制作药敏纸片用于治疗。可在本场药品范围内或本地区容易买到的药品中选出最敏感的药物。还可在短时间内选择最佳药品和最佳剂量，既能缩短病程，又能避免盲目用药，减少浪费。
四、根据药敏试验选药原则
完成药敏试验后，应根据结果选择敏感性较高，同时价廉、易得、安全的药物进行治疗，以减少耐药菌株，同时还应注意以下原则：
1、在选择高敏药物时还应考虑药物的吸收途径。因为药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，所以在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。
2、药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。因动物机体及环境等因素影响，药物的药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为70－80%，所以也不能过分地依赖药敏试验。如发现疗效不显着应及时换药。
3、药敏试验确定的首选药物不是一成不变。随着药物使用频率的增加及新特药的不断出现，细菌对原先的高敏感药物可能不再敏感。因此，定期进行药敏试验了解本场细菌对抗菌药的敏感性情况是很有必要的。
4、窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要用两种药物联合应用。必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。
5、避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。

四、影响药敏试验结果的因素
在以纸片法进行药敏试验时，以下几方面因素可影响试验的结果：
1、培养基：首先应根据试验菌的营养需要选择适宜的培养基。培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。其次，倾注平板时，厚度应合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
2、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
3、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
4、培养时间：一般细菌培养温度和时间为37℃ 12-24小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。

五、药敏试验存在的问题
当前进行药敏试验仍然存在一些问题，主要包括以下几方面：
1、方法学不统一，没有标准化。
2、市场提供的药敏试验的培养基、药敏纸片等缺乏严格质控，质量难以保证。所以还是建议按要求自制药敏纸片。

兽医临床中的药敏试验

兽医临床中的药敏试验
目前由各种细菌所引起的疾病给畜禽养殖业带来严重经济损失，阻碍了养殖业的快速发展，所以使用抗菌药预防和治疗细菌性疾病成了畜禽养殖过程中的一项重要工作。但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且耐药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。因此，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。
一、什么是药敏试验？
抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility test，AST），简称药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。药敏试验是兽医临床工作中的一项基本技能，也是使用抗菌药物治疗前必不可少的一道环节。

二、药敏试验的意义
1、可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药。因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。是一种既经济又有效的方法。
2、可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行。因为随着新型致病菌的不断出现，各种致病菌对不同的抗菌药的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药的敏感性也有差异。进行有效的药敏试验可以及时掌握各种新型菌种和菌株的耐药性，对流行病学调查建立监控，同时采取相应的措施也就可以控制和预防耐药菌株的流行。
3、为临床用药提供参考依据。因为一个正确的药敏试验结果，可作为临床兽医和畜禽养殖者选用有效抗菌药的参考。长期以来，由于各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药药效下降或消失。不能很好的掌握药物对细菌的敏感程度，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。近十几年，在肉鸡生产中，为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，一些抗菌药物的盲目使用，导致耐药菌株越来越多。根据已进行的大量药敏试验结果，大肠杆菌、沙门氏菌对曾经敏感的氨基糖苷类、氟喹诺酮类等，均产生了不同程度的耐药性，经常发现对十几种常用抗菌药都不敏感的菌株。这是一个非常危险的信号。所以在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。

三、常用的药敏试验方法
兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。其中扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。
由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数实验室和基层单位所采用。扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前牛津杯法和打孔法在兽医临床已较少应用。以下简单介绍纸片法。

1、药敏纸片的制作
纸片法中使用的药敏纸片目前市场上已有较多厂家的产品销售。但也可根据需要自制，具体自制的方法如下：
取质量较好的定性滤纸，用普通的打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或小平皿中，以单层牛皮纸扎口或包扎。经15磅15-20分钟高压灭菌后，置于37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。按每张纸片饱和吸水量为0.01ml计，在上述含有50片纸片的小瓶内加入药液0.5ml，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30分钟即可。同时在记录药物名称，于37℃温箱过夜。在温箱或烘箱中的时间不宜过长，以免某些抗生素失效。青霉素、金霉素宜在低温下真空干燥。干燥后即密封。切勿受潮，置阴暗干燥处或家用冰箱中保存，有效期4-6个月。

2、药液的制备
自制药敏纸片时还需自行配制抗菌药液。抗菌药的稀释剂通常用蒸馏水。一般可按商品药使用说明书上的配料或饮水浓度，按1g需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。如10g药物可配50kg饲料，其换算方法为：1g本品加5000ml蒸馏水。此溶液液即为用于做药敏试验的药液。

3、试验操作方法
在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。然后用无菌镊子将纸片放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。一般各纸片中心相距应大于24mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5－6片。记住每种药敏纸片的名称。贴完纸片的平皿15分钟后再置于37℃温箱中培养16－24小时，观察记录结果。以药敏纸片周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。
药敏试验结果判定标准
抑菌圈直径（毫米）敏感性
＞20极敏感
15-20高敏感
10-14中敏感
＜10低敏感
0不敏感
实践证明，利用自制药敏纸片进行药敏试验，可以灵活选药，与某病菌相关的药物均可随时制作药敏纸片用于治疗。可在本场药品范围内或本地区容易买到的药品中选出最敏感的药物。还可在短时间内选择最佳药品和最佳剂量，既能缩短病程，又能避免盲目用药，减少浪费。

四、根据药敏试验选药原则
完成药敏试验后，应根据结果选择敏感性较高，同时价廉、易得、安全的药物进行治疗，以减少耐药菌株，同时还应注意以下原则：
1、在选择高敏药物时还应考虑药物的吸收途径。因为药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，所以在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。
2、药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。因动物机体及环境等因素影响，药物的药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为70－80%，所以也不能过分地依赖药敏试验。如发现疗效不显着应及时换药。
3、药敏试验确定的首选药物不是一成不变。随着药物使用频率的增加及新特药的不断出现，细菌对原先的高敏感药物可能不再敏感。因此，定期进行药敏试验了解本场细菌对抗菌药的敏感性情况是很有必要的。
4、窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要用两种药物联合应用。必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。
5、避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。

四、影响药敏试验结果的因素
在以纸片法进行药敏试验时，以下几方面因素可影响试验的结果：
1、培养基：首先应根据试验菌的营养需要选择适宜的培养基。培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。其次，倾注平板时，厚度应合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
2、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
3、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
4、培养时间：一般细菌培养温度和时间为37℃ 12-24小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。

五、药敏试验存在的问题
当前进行药敏试验仍然存在一些问题，主要包括以下几方面：
1、方法学不统一，没有标准化。
2、市场提供的药敏试验的培养基、药敏纸片等缺乏严格质控，质量难以保证。所以还是建议按要求自制药敏纸片。
3、因需要先进行细菌的分离培养，所以药敏试验报告出结果时间长，检验与临床缺乏沟通，对于基层兽医站或养殖场，药敏结果不能满足临床治疗要求，容易延误治疗时机。但根据有关报道，也可进行简易的药敏试验，方法如下：无菌取病死畜禽的部分肝、脾等组织，按1：5加生理盐水研磨制成悬液，静置5分钟，用无菌吸管吸悬液，加两滴于营养琼脂板上，涂布均匀，5分钟后贴上药敏试纸，培养、观察抑菌圈大小。
4、对于部分营养需求较高的细菌或微生物，如链球菌和支原体，临床上较难培养，限制了药敏试验的应用。
5、部分养殖场或基层兽医站缺乏做细菌分离培养和药敏试验的意识。绝大多数养殖者或技术人员是在没有明确微生物学诊断的情况下使用抗菌药物，养殖场规模越小，细菌培养和药敏试验做的越少，有的养殖场轮翻使用多种抗菌药物而不做细菌培养和药敏试验，致使疗效不佳，治疗时机延误和药品的浪费。一些病例用药前不做药敏试验，而是在大量使用多种抗菌药物疗效不明显时才想起做细菌培养和药敏试验，而此时细菌已对多种抗菌药产生耐药性。

‘叁’ 为研究基因a与四膜虫的耐药性是否有关，科研人员提取耐药个体的dna，用图2所示

亲和层析的原理与众所周知的抗原-抗体、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的底物（S）才能和一定的酶（E）结合，产生复合物（E-S）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶-底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把固相载体装人小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲液的pH值、或增加离子强度、或加入抑制剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差异）时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。

‘肆’ 有关动物营养实验设计问题想请教大家

谢谢韩老先生的建议，确实选题太大！ 手边没有动物营养元素需求量实验设计方面的好教材！ 您能否推荐几本有关动物营养实验设计方面的好书或文章！ 网上搜索到有关类似的实验报告很多，但良莠不齐。很想弄明白：如何才能确定并优选出最佳实验方案？ 缩小范围，比如确定南美白对虾（5.0-8.0cm）在高密度养殖条件下，对脂肪的最佳需求量的确定，应该如何设计？:huahua: [ ]

‘伍’ 如何设计条件性基因敲除小鼠模型

设计条件性基因敲除小鼠模型要根据实验要求以及设计需要来建立模型。

基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。

有关基因敲除实验鼠的信息可以咨询赛业生物，赛业生物已服务全球数万名科学家，产品和技术已直接应用于包括CNS（Cell，Nature, Science）三大期刊在内的学术论文。除了提供基因敲除、基因敲入、条件性基因敲除模型定制服务外，赛业生物还有专业的手术疾病模型团队，可以提供多种复杂精细的小动物手术疾病模型；药物筛选评价小鼠平台可以提供从欧美行业领袖引进的免疫缺陷鼠、用于心血管及阿尔茨海默症等研究的人源化小鼠；国际标准化无菌鼠技术平台可以提供无菌鼠、无菌动物定制服务、微生物菌群移植服务等基于无菌动物模型的各类产品和服务，结合赛业生物成熟稳定的基因编辑小鼠平台，还可帮助您研究菌群与基因的互作机制。

‘陆’ 如何做耐药基因研究

首先要清楚自己要做什么耐药基因，是对哪种抗生素的耐药。明确后，要注意从宏观和微观入手。
在宏观上，要知道细菌对哪些抗生素耐药，即该种细菌的耐药特征，这也是所谓的药敏试验。
在清楚宏观结果的前提下，我们再去研究它具体含有哪些耐药基因。因为细菌的耐药性的出现，大部分源于基因的改变，如基因突变或者获得了外来耐药基因元件等。你可以针对具体的抗生素，查找相关文献，探知目前对该种抗生素的耐药基因的研究进展，确定引起该种抗生素耐药的有关具体基因。然后设计该基因引物,通过PCR技术扩增确定。
但是大部分细菌的耐药都不是单一原因的。具体研究就得看你的研究目的了。
大概说了这么点，希望对你有帮助！

‘柒’ 用实验动物来进行毒性试验是有其必要性，请详述其毒性测试的主要原则与必要性

摘要 原则上用二级动物，啮齿类非啮齿类。

‘捌’ 如何用crisp/cas9制作转基因小鼠

用crisp/cas9制作转基因小鼠需要在胚胎上进行。

诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。

需要实验小鼠的可以联系苏州赛业。赛业生物已服务全球数万名科学家，产品和技术已直接应用于包括CNS（Cell，Nature, Science）三大期刊在内的学术论文。除了提供基因敲除、基因敲入、条件性基因敲除模型定制服务外，赛业生物还有专业的手术疾病模型团队，可以提供多种复杂精细的小动物手术疾病模型；药物筛选评价小鼠平台可以提供从欧美行业领袖引进的免疫缺陷鼠、用于心血管及阿尔茨海默症等研究的人源化小鼠；国际标准化无菌鼠技术平台可以提供无菌鼠、无菌动物定制服务、微生物菌群移植服务等基于无菌动物模型的各类产品和服务，结合赛业生物成熟稳定的基因编辑小鼠平台，还可帮助您研究菌群与基因的互作机制。

‘玖’ 如何从一些有抗生素抗性基因的微生物中筛选出无抗性基因的突变体

这个可以需要做大规模的筛选。
利用无抗性的固体培养基，挑取单克隆，再划线到有抗性的固体培养基中，没有生长的就可以提取DNA，送去测序确认了。
望采纳，谢谢

‘拾’ 如何设计elisa实验验证抗体是不是鼠单抗

摘要 操作步骤：