❶ 腐草霉素可以筛选哺乳动物细胞吗
你指的是精母细胞（卵母细胞）还是精子（卵细胞）？前者是可以体外培养的，但是后者由于已经高度分化不会在像体细胞一样分裂。所以不能体外增值
❷ 红细胞不规则抗体筛选实验
不规则抗体筛选实验有红细胞不规则抗体筛选实验，红细胞不规则抗体筛选实验对于输血来说是很有意义的，可以预防输血出现的一系列不良情况，做红细胞不规则抗体筛选实验有一些事项要注意，接下来我们来具体说下红细胞不规则抗体筛选实验的相关知识吧。
红细胞不规则抗体筛选实验目的
不规则抗体筛选有红细胞不规则抗体筛选，那么红细胞不规则抗体筛选实验目的是什么呢？
由于有临床意义的红细胞不规则抗体会导致溶血性输血反应，破坏输入的不配合的红细胞或缩短其寿命，产生溶血性输血反应，轻则影响治疗效果，重则危机病人生命；此外，对孕妇而言，不规则抗体会引起新生儿溶血病，影响新生儿脏器的发育，并使其智力发育受到伤害，严重者则会危及新生儿的生命安全。因此，抗筛选是很必要而且必须的。
对需要输血治疗的患者，进行红细胞不规则抗体筛查，可以有助于血液选择，从而有充分的时间来选择不含有针对某抗体的响应抗原的血液，从而防止因为输注含有某抗体相应抗原的血液而引起溶血性输血反应，保证输血安全。
红细胞不规则抗体筛选实验意义
红细胞不规则抗体筛选实验比较少见，那么红细胞不规则抗体筛选实验意义是什么呢？
红细胞不规则抗体的检测与临床输血的安全性和有效性密切相关。随着输血技术的发展，红细胞不规则抗体的检测方法不断丰富、检测水平不断提高，越来越多的不规则抗体被发现。因此，输血技术人员有必要深入了解不规则抗体的重要性。
本身红细胞也称红血球，在常规化验中英文常缩写成RBC，是血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介，同时还具有免疫功能。哺乳动物成熟的红细胞是无核的，这意味着它们失去了DNA。红细胞主要是通过无氧糖酵解来释放能量，而其中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶就是红细胞进行无氧糖酵解的必须的酶类。如果这些酶活性下降或缺失，红细胞就不能进行无氧糖酵解。
红细胞不规则抗体筛选实验有必要做吗
红细胞不规则抗体筛选实验不是每个人都做的，那么红细胞不规则抗体筛选实验有必要做吗？
红细胞不规则抗体筛选实验有必要做。本身不规则抗体主要是经输血或妊娠等免疫刺激产生，在盐水介质中不能凝集而只能致敏相应抗原的红细胞，必须通过特殊介质才能使致敏红细胞出现凝集反应。临床上通常所称的“同型血”实际上是指ABO血型系统和Rh血型系统相同，其它红细胞血型系统未必相同。如果交叉配血不仔细，或者只用盐水介质配血，则有可能检查不出ABO血型系统之外的不规则抗体，而此抗体与相应抗原发生免疫反应，可导致溶血性输血反应的发生。
通常情况下红细胞可以运输氧气，也运输一部分二氧化碳。运输二氧化碳时呈暗紫色，运输氧气时呈鲜红色。红细胞会生成于骨髓之内。红细胞老化后，易导致血管堵塞，所以会自动返回骨髓深处，由白细胞负责销毁；或是在经过肝脏时，被巨噬细胞分解成为胆汁。
红细胞不规则抗体筛选实验案例
对于红细胞不规则抗体筛选实验感受是因人而异的，那么红细胞不规则抗体筛选实验案例有哪些呢？
红细胞不规则抗体筛选实验案例为取试管三支，标明Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ并往各管加病人血清（血浆）2滴，加5%筛选细胞（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）各1滴。各加LIM0.7ML，混合均匀后，再各加Polybrene 溶液2滴，并混合均匀。用BASO专用离心机1000G离心力，离心10秒，然后把上清液倒掉，不要沥干，让管底残留约0.1ML液体。轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重作。最后加入Resuspending 2滴，轻轻转动试管混合并同时观察结果。如果凝集散开，表示是由Polybrene引起的非特异性聚集，抗体筛检结果为阴性；如凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，抗体筛检结果为阳性，应进一步作抗体鉴定。
虽然红细胞不规则抗体筛选阳性率仅为0.37%，但是该项阳性的患者一旦输入具有相应抗原的红细胞，抗原、抗体发生免疫性结合，在补体的参与下，使输入的红细胞发生溶解，即发生溶血性输血反应。患者出现发热、贫血、黄疸和血红蛋白尿，严重时甚至危及其生命。因此，在输血中要经常警惕这种输血反应发生的可能性。当红细胞不规则抗体筛选阳性时，必须进一步作抗体鉴定，确定其特异性后，再输入无相应抗原的红细胞，才能达到安全输血之目的。
❸ G418原代细胞如何筛选
博凌科为解答：分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80%的进入 核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。细胞 基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄 取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列 （neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它 通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用 的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效 表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛 应用。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。其实G418本身有很好 的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所 用培养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙 类药物，其药理作用完全一样。所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际 操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。Protocal1.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。3.制备筛选培养基：在100g/ml～1000g/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100g/ml、400g/ml、800g /ml、1000g/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。4.加G418筛选： 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不 大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是 400g/ml不能杀死细胞，而800g/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500g/ml、600g/ml、700g/ml进一 步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染 NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200g/ml。这时你就可以做150g/ml、 200g/ml、300g/ml三个浓度进行筛选
❹ 求稳定细胞株筛选的protocol，求助各位大神
稳定细胞株筛选是一个长期的过程，稳定细胞株筛选优化，有许多条件需要摸索，而且是从源头开始
① 在构建载体时，目的基因直接整合到细胞染色体组上，最好不要通过先瞬转在筛选稳定细胞株的这种方法，因为转染效率没有保证
② 高表达载体的构建，哺乳动物表达量一直是它自身的缺点，最好根据高表达载体定向的驯化细胞，提高蛋白表达量
③ 细胞的选择，筛选稳定细胞株我们常用的细胞是CHO，中国仓鼠卵巢细胞，由于CHO具有诸多的优点因此适合用于筛选稳定细胞株，而HEK293细胞则常用于瞬时转染
④ 后期的筛选，双抗预防污染，筛选细胞的时候抗生素浓度一定要做预实验，而且转染的时候不能有抗生素，关于细胞转染 稳定细胞系构建的相关理论
❺ 哺乳动物的红细胞怎么提取
利用红细胞在低渗液中吸水涨破的原理破裂红细胞，并利用红细胞膜蛋白与血红蛋白分子量的不同，通过高速离心分离红细胞膜蛋白和血红蛋白。
采用NH4Cl作为低渗液。
人红细胞膜的提取:取人全血按1:4的比例加入
0.9%NaCl（生理盐水）离心，去上清；将沉淀用生理盐水1:1稀释，加入等量的淋巴细胞分离液，离心取最下层的红细胞沉淀，按1:20的比例加入红细胞膜裂解液，4度处理2h，离心去上清，收集乳白色沉淀。
❻ 关于克隆
克隆一词是英文单词clone的音译，作为名词，c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如：同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而，天然的哺乳动物克隆的发生率极低，成员数目太少（一般为两个），且缺乏目的性，所以很少能够被用来为人类造福，因此，人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样，克隆一词就开始被用作动词，指人工培育克隆动物这一动作。
目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。
采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯·施佩曼在1938年提出，他称之为“奇异的实验”，即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。
从1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。
哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年，施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年，尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。
二、克隆羊“多莉”的意义和引起的反响
以上事实说明，在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。
在理论上，利用同样方法，人可以复制“克隆人”，这意味着以往科幻小说中的独裁狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此，“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界乃至宗教界都引起了强烈反响，并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国政府有关人士、民间纷纷作出反应：克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此，克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐，从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。
三、近3年来克隆研究的重要成果
克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月，即“多莉”诞生后1个月，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。
1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。
此后，美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息；日本科学家的研究热情尤为惊人，1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方（石川县、大分县和鹿儿岛县等）家畜试验场以及民间企业（如日本最大的奶商品公司雪印乳业等）纷纷报道了，他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。
2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得，与克隆“多莉”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。
在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果，1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎，这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。
四、克隆技术的应用前景
克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。
转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。
体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。
胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型，来替代那些受损的体内组织，比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞，使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前，科学家已成功分离到人ES细胞（Thomson等1998，Science），而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞），用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体，科学家们称之为“治疗克隆”。
克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具。
五、克隆技术存在的问题
尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域，克隆技术在理论和技术上都还很不成熟，在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。
在实践中，克隆动物的成功率还很低，维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了“多莉”这一只成活羔羊，成功率只有0.36％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7％和1.1％，即使是使用“檀香山”技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体，其成功率也只有百分之几。
此外，生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例，日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去；到2000年2月，日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生，但存活的只有64头。观察结果表明，部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平；有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育；克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向，这些都可能是死亡的原因。
即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象。染色体的未端被称为端粒，它决定着细胞能够分裂的次数：每一次分裂端粒都会缩短，而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年，科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短，即其细胞处于更衰老的状态。当时认为，这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的，使其细胞具有成年细胞的印记，但这一解释目前受到了挑战，美国马萨诸塞州的医生罗伯特·兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5～10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因，也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明，在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟，使其“恢复青春”，关于这种变化对克隆动物寿命的影响，还有待于进一步观察。
除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性，在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月，英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告，表明英国政府将重新考虑这一决定，认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举，关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。
❼ 特定细胞是怎么提取的
免疫细胞从外周血的提取，经过离心、分离及细胞收集，特定的免疫细胞可以通过流式进行分选。
❽ 哺乳动物细胞发育分子追踪器
多细胞生物仅仅由单个细胞发育而来的整个生物学过程令人震撼。经典的谱系追踪实验已经用于追踪线虫单细胞到多细胞的发育过程，并发现了细胞谱系和表型方面的差异。但更复杂的生物体是如何精妙地调控细胞的发育过程仍不清楚。
线虫作为一种模式生物，其细胞发育的过程已经被研究地较为透彻，但高等生物尤其是哺乳动物中细胞的发育过程异常复杂，没有很好的工具来记录细胞发育的大跨度发育过程。
目前，以CRISPR-Cas9为基础的技术已被用于记录细胞谱系发生，整合scRNA测序技术揭开了胚胎发育神秘的面纱。然而这些研究的barcode缺乏多样性，很大程度上限制了在其他生命体中的应用。
为了进一步揭开哺乳动物早期胚胎发育过程，作者 基于CRISPR-Cas9技术开发了一套细胞谱系追踪记录器 ，为小鼠原肠胚发育过程的研究提供了可用的工具。
理想的多细胞生物发育分子追踪器需要满足以下要求：
首先设计包含荧光蛋白的分子追踪器模型，验证追踪器模型的可行性。
靶点设计
a. 合成的靶点包含3个切割位点
b. 包含8 bp整合的barcode
c. 连接于荧光蛋白的3`非编码区
sgRNAs
使用Cas9产生双链断裂修复后造成可遗传的插入或者缺失突变。用于记录信息的是包含3个切割位点以及8碱基对的“整合条码”205个碱基对的合成DNA。该合成DNA序列被嵌入组成型转录的荧光蛋白3`非翻译区，从而能够通过荧光从转录组中分析实验结果。另外一个cassette编码了三个guide RNA，可用来记录多种信号。
基于构建好的分子追踪器模型来进行切割实验和性能验证。
此基因编辑系统能够产生大量的可遗传修复结果和目标位点，并且可以通过整合条码对这些序列进行区分。
为了筛选能够控制突变比例的序列，用于长期时间的试验切割，链接GPF报告基因，通过对含报告基因的细胞的比例进行统计（20天的大跨度）。
sgRNA中的突变（单和双突变）设计在了前间区序列邻近基序（PAM）的附近，这些guide RNA是作者通过筛选得到的，使用GFP报告基因在超过20天的时间对guide RNA靶标的活性进行监控，从而筛选具有广泛动态变化范围的序列。
分子追踪器模型验证有效后，进行载体构建和单细胞培养实验。
开展小鼠细胞实验，将多个靶点整合到基因组中之后，又将组成型的Cas9-GFP编码的精子释放到卵母细胞之中启动切割，收集E8.5-E9.5胚胎用于下游分析。
基于10x Genomics平台的建库测序流程示意图：
为了证明该技术的谱系追踪能力，他们对于胎盘、卵黄囊以及胚胎局部组织（3小份）中的靶点进行扩增，并且通过插入、缺失标记的相似性来研究这三者之间的关系，从而评估该技术的实用性。
基于细胞表型数据对单细胞进行分配，得到组织层面的单细胞分类结果。
通过细胞形态表达特征分配细胞，只展示第2号胚胎（1 of 7），共注释了22,264细胞，能将细胞进行很好的分类。
基于已知的maker基因对单细胞进行分类和注释。
该图展示了典型的组织marker基因，按照不同的胚层进行分类（marker阳性细胞减少），但是特异性较高。
点的大小代表marker基因阳性的细胞比例，颜色代表归一化的表达量（cluster mean值）。
基于插入、缺失标记多态性构建细胞谱系的进化树，来构建细胞发育的过程。
（1）谱系进化树的构建
基于InDel加权log-likelihoods值，构建谱系进化树，并将细胞类型信息叠加进行标记，从进化树的根部到分支可以发现细胞类型是逐渐特化的。其中，每一个分支代表一个InDel生成事件。
（2）单细胞排序策略
通常来说轨迹分析常用于细胞排序，本文使用改良后的汉明距离来评估成对细胞间的谱系距离。
基于单细胞测序结果建立系统发育树后发现，细胞谱系发育距离越近，转录谱的相似度越高，该结果与细胞在发育过程中逐渐分化成特化的细胞类型相一致。
经过分析，部分单细胞的真实来源与谱系分析结果并不一致。
胚外内胚层 (EEndo)和胚胎内胚层 (Endo)分别起源于下胚层和上胚层，但祖源打分很高。
Endo和EEndo祖源打分很高说明两组细胞很来源一致，但是其真正起源却截然不同。原因是部分Endo细胞被分配给了EEndo分支。
分离Endo胚胎内胚层谱系细胞，绘制谱系树，发现部分细胞中Trap1a和Rhox5（EEndo标记基因）高表达。其他的胚胎中均发现这个现象。
对不同类型的胚胎组织细胞进行谱系追踪溯源和比例计算，从而对细胞发育图谱过程中各种细胞类型进行定量。
图a：起源于多能祖细胞的组织分布比例，多能细胞形成所有的胚层，但对不同的细胞命运表现出不对称的倾向。（灰色的为node，星号标记，生成原始生殖细胞），横轴是谱系（n为细胞数目）图b：灰点代表胚胎，连线连接着相同胚胎的估计。
一、开发了基于CRISPR-Cas9的工具用于追踪细胞发育进程
二、实现了哺乳动物原肠胚形成过程细胞命运谱系示踪
三、实现较长时间跨度下各发育阶段的细胞状态追踪和定量
四、可用于构建哺乳动物整个发育时期细胞命运图谱
Chan, M.M., Smith, Z.D., Grosswendt, S. et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature 570, 77–82 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-1184-5
❾ 信号肽昨天我已经找到了。还有个问题，
哺乳动物细胞表达异源蛋白质，构建的基因转录的出mRNA必须是单顺反子。所以你的两个抗体链需要两个启动子来驱动表达。
两个基因要同时转到一种细胞里去，可以考虑将两个基因分别构建两个载体，然后进行共转染，再筛选阳性细胞；
或者，先向细胞系转染一个载体，筛选出阳性细胞之后，再向其转染另一个载体，最后筛选出两种基因都表达的细胞系。
❿ G418的选择细胞原理是什么
G418的选择细胞原理：
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
由于每种细胞对G418的敏感性不同，一般变动在100ug/ml～1000ug/ml范围。在筛选之前，一定要确定细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。
加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。
为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除阴性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或者用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。
一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。
G418（Geneticin,遗传霉素） 是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞DNA后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA ,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。