动物组织测细胞因子可以冰冻多久

1. 测细胞因子 可以液氮快速冻融裂解细胞吗

反复冻融法裂解细胞：
1、将细胞在-20
度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2、至少3次以上冻溶。
3、IFCC推荐法： 收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。
4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻

2. 做SOD检测时,由于实验室条件限制，没有液氮，动物组织可以直接先冻存再在-80℃冰箱吗

可以的 一般-80冻不超过三天都没什么影响 亲测

3. 我准备提取动物组织进行凋亡细胞DNA ladder的检测，该动物组织再提取DNA之前可否保存，怎么保存谢谢各位

必须先冷冻,有条件的话,切下组织之后,马上丢到液氮里速冻,冻透了之后,放在-80冰箱里保存,用之前,放在液氮里,然后再研钵中加液氮,快速研磨,OVER

4. 全血标本冻存后可以测细胞因子吗

1、取血后最好能放到37度水浴箱中1小时左右,这样有助于纤维蛋白原凝集,在冻得时候也最好不要把血清和血细胞一起冻,血细胞反复冻融会破碎,里面的物质很容易混到血清中,而且血清冻后再放到室温作试验,实际上血清里面会产生分层,你取得部分并不能代表血清整体情况,你做试验前血清融化后需要混匀才可以,而你带着血细胞怕不好混匀吧,所以我觉得最好不要一起冻
2、如何解冻血清才不会使产品质量受损?
我们建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。
3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现， 该如何处理?
血清在解冻过程（包括没有完全解冻）或储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如凝集素、纤维蛋白原和玻连蛋白等）可能会聚集成团，形成絮状沉淀或外观混浊；在运输过程中，由于时间较长，所以往往有少许解冻，因此也可能稍有沉淀，但这些都不影响血清性能。若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤

5. 检测某种细胞因子在肿瘤组织中的表达情况需要同时做pcr跟western blot 吗

大鼠灌注取脑；用途：；1.用于常规HE染色，免疫组化分析；2.冰冻切片可以不做脑组织固定；3.不可用于westernblot和PCR；4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作；原理：；心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织；必要性：；1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易；2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤；3.脑内血液

大鼠灌注取脑

用途：

1. 用于常规HE染色，免疫组化分析。

2. 2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3. 3.不可用于western blot和PCR。

4. 4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

5. 原理：

6. 心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

7. 必要性：

8. 1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

9. 2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

10. 3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。

11. 大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：

12. 流程：

13. 1) 麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.

14. 具体过程：

15. 大鼠经深度麻醉后，固定于自制的木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。

16. Tips：

17. 1.多聚甲醛的配置：

18. 一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

19. 简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。

20. 2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。

21. 3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔麻醉动物。

22. 4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。

23. 5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排液的有效观察指标。

24. 6.继续用4%多聚甲醛灌流250ml固定。

25. 7.后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。

26. 补充：

27. 还有一种省时省剂的方法。

28. 夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。

29. 灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。

30. 
    

6. 想做冰冻切片我要怎么准备动物组织

冰冻切片是不需要固定的,冰冻切片新鲜取材后，应立刻放入冰冻切片机内切片。如不能立即切片，要放入液氮中速冻，然后放在-70度低温冰箱内长期保存抗原性不会丢失。
在手术台上取下的组织放到冷冻机里面-20度左右冻成硬块,制成切片用于快速诊断,该诊断仅作参考,应以石蜡诊断为主。
低温恒冷箱冷冻切片制作法以Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机为例，该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉

7. 常用的细胞因子检测方法有哪些

（1）生物学检测法：又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。生物活性检测法又可分为： 1、细胞增殖法； 2、靶细胞杀伤法； 3、细胞因子诱导的产物分析法； 4、细胞病变抑制法。
（2）免疫学检测法：细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性，可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子，常用的方法包括ELlSA、RlA及免疫印迹法
（3）分子生物学方法：目前公认的细胞因子的基因均已克隆化，较容易地得到某一细胞因子cDNA探针或根据已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探针。常使用斑点杂交、Northernblot、逆转录PCR，细胞或组织原位杂交等。具有灵敏、快速等优点，甚至从l～10个细胞中就可检出其中的特异mRNA

8. 细胞因子检测方法哪位了解，好一些的生物学科网有哪些

目前，细胞因子已广泛应用于临床的已有EPO、IFN-α、G-CSF、GM-CSF以及试用于临床的白细胞介素等。为了研究细胞因子在生理系统的作用以及了解细胞因子产品用于临床治疗的效果，进行细胞因子的检测就必不可少，而且用于临床诊断的细胞因子分析方法必须适用于常规操作。细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采用的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床治疗带来一定的困难。因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响细胞因子浓度的因素。 1 原理和方法细胞因子的发现依赖于其生物学活性，因此，建立了生物分析法用于细胞因子的检测。随后，用于检测实验溶液(如组织培养上清液)中细胞因子的免疫分析法被建立，并不断用于实验室研究。但准确地、可重复地测定细胞因子具有一定困难，主要原因是众所周知的细胞因子的含量极低(大部分都是以pmol/L计)，同时存在着源于异嗜性抗体，类风湿因子以及特异的和非特异的细胞因子结合蛋白等的显着干扰。在生物帮那里可以详细的了解一下，那里有很多实验领域的精品技术文件，并且图文并茂，提供生物领域的学科知识、实验技术方法与技巧等please click to connect www.bio1000.com/zt/cell/46213.html .that can help you细胞因子生物学活性检测和浓度测定的分析方法主要有以下几类。1.1 生物分析法 生物分析法方便，敏感性高，但所有细胞系有可能受几种细胞因子的影响，特异性则较差。又由于可溶性细胞因子受体等抑制剂的存在，使生物分析法可能低估细胞因子的活性。常用的方法有2种:(1)依赖性细胞株增敏实验。一些肿瘤细胞株依赖于细胞因子方能在体外增殖，如TF-1细胞株依赖于GM-CSF和IL-3，CTLL细胞株依赖于IL-2，TTD-1细胞株依赖于IL-6等 。可利用这些依赖株检测相应的细胞因子。但是，并非所有细胞因子均有相应的依赖株，因此限制了此法的应用。(2)功能检测实验。利用一些细胞因子的功能特性而建立相应的活性测定方法。如IFN抗病毒实验和TNF对L 929 细胞的杀伤作用等 。此外，生物分析法还有骨髓集落形成实验，细胞毒或细胞抑制实验，次级分子分泌的诱导，化学趋化和细胞因子分泌性的抑制实验等。1.2 免疫分析法 利用抗原机体反应的原理，制备出抗细胞因子的单抗或多抗，可进行细胞因子的免疫检测，它包括放免实验(RIA)和酶联免疫吸附实验(ELISA)等。其优点是高特异性、高灵敏度、操作简便。缺点是不能证明被测细胞因子是否为具有完整生物活性结构的蛋白质而非变性蛋白质。1.3 CKmRNA的测定 (1)分子杂交实验:首先制备出细胞因子的基因探针，通过分子杂交检测细胞内CKmRNA的表达。(2)逆转录PCR(RT-PCR)法技术:可快速、灵敏地检测表达很低的CKmRNA，并可同时测定同一样本中多种CKmRNA，操作过程包括细胞因子产生细胞的RNA提取，mRNA经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行PCR扩增。根据定量CKmRNA方法和原理的不同，可分为半定量PCR法，竞争性定量PCR法，内参标定量PCR法，HPLC-PCR法和酶联免疫定量PCR法。目前市售的商品试剂盒已能用于大多数细胞因子的检测，但因其价格昂贵而阻碍了其广泛使用。同时，人细胞因子的测定仍存在许多问题，检测方法选择不当可能得到不一致的结果，有时有必要选择一个以上的检测方法测定细胞因子。 2 灵敏度细胞因子具有很强的生物学活性，其生物分析法的灵敏度极高。然而，在测定血浆中细胞因子正常浓度时，难以确定免疫分析法令人满意的灵敏度。不同细胞因子的参考值变化很大，难以定义其参考值范围。如Damas等[7] 在研 究细胞因子与败血症时，使用两步免疫放射测定实验(IRˉMA)测定IL-6(灵敏度:5ng/ml)一步IRMA法测定TNF-α(灵敏度:5ng/L)和IL-1β(灵敏度:4ng/L)，在正常血清中未测得上述细胞因子。而Riikonen等使用具有相似检测限的RIA法，在20例健康儿童中，IL-1β的平均浓度为12.1ng/L，IL-6的平均浓度为83ng/L;在71例健康儿童中，TNF-α的平均浓度为40±2ng/L。由此可见，不同的免疫分析方法之间存在极大的差异，其灵敏度变化可能是由于其准确度和特异性的不同而引起。3 准确度和特异性影响细胞因子检测准确度和特异性的因素有:(1)抗体:单抗的表位识别;(2)细胞因子:多种分子形式，结合蛋白复合物、抑制剂和可溶性受体复合物;(3)血浆基质:干扰抗体，异嗜性抗体和类风湿因子;(4)标准:重组参考物质可能不显示与样品平行的剂量———反应曲线。3.1 细胞因子结合蛋白 已知IL-1β、TNF-α和IL-6能结合从细胞进入血浆的可溶性受体或特异的拮抗剂。免疫分析法是否能识别这样的结合形式几乎是未知的，但是对TNF的研究得出了一些重要结论。20世纪80年代后期，《Lancet》上发表了大量关于癌症病人TNF-α测定缺乏可靠性和生物分析法与免疫分析法关系的文章。但使用竞争性免疫分析法时，癌症病人与败血症病人的TNF-α是可被检测的。而ELISA法由于不能测定TNF-α与P 55 TNF受体的结合物而无法测定癌症病人血浆中的TNF-α。3.2 血浆中包含几种形式的IL-6分子，它们与一些抗血清的作用较弱，缺乏生物学活性并与其它血浆蛋白质以及IL-6的可溶性受体组成复合物。已知IL-6免疫分析法和生物分析测定其在正常血清中的浓度为0或在10～75ng/L范围，败血症病人的IL-6浓度升高到1～2μg/L，脑膜炎病人的IL-6浓度升到200μg/L。然而，May等说明大多数的检测方法仅仅测定了低分子量的IL-6，他们采用能识别IL-6高分子量的单抗，测得在正常血清中IL-6的浓度为1～10μg/L，并且在1例骨髓移植后病人的血清样品中，测得IL-6的浓度为5～10mg/L。3.3 多种分子的形式 一些细胞因子的多种分子形式已被充分认识，但是其对细胞因子测定影响的重要性并未得到彻底的研究。IL-6是一个最好的例子，它由一个位于第7染色体上，包含5个外显子的单一多杰基因编码。其氨基酸序列包括几个潜在的O-糖基位点，2个N-糖基位点和几个丝氨酸磷酸化位点。由细菌产生的重组IL-6的相对分子量为21Kd。人成纤维细胞至少分泌6种形式，相对分子量为23～30Kd的IL-6，它们均是糖蛋白，能在败血症病人的血浆中被检测。人内皮细胞分泌一种分子量为45Kd的IL-6，它似乎是血浆中的IL-6的主要存在形式。3.4 人血浆中的干扰物质 血浆中通常包含有与IgG反应的抗体。这些异嗜性的抗体可影响夹心免疫分析法，它们在俘获抗体和被标记的抗体间形成桥梁，而错误地导致高分析值。研究表明，15%～40%的病人样本中含有能够干扰检测的抗体。异嗜性抗体能与鼠、兔和牛血清免疫球蛋白发生反应，在大多数情况下，它们与牛IgG的结合最强。在检测中，加入正常的非免疫动物血清吸附异嗜性抗体，常能够消除这种形式的干扰。3.5 类风湿因子是IgM的自身抗体 Hamilton等的研究说明，IgM类风湿因子与鼠IgG的结合发生于1%的健康献血者和31%的类风湿关节炎病人。然而，也有研究表明，在9.1%的正常献血者中发生了这类结合。这些抗体可造成与异嗜性抗体完全相同的影响，并且他们在对细胞因子检测具有特别意义的类风湿病患者中的浓度极高。

9. 细胞因子检测可以用哪些方法，简述其原理

细胞因子主要是指由内分泌细胞分泌的一类可以参与免疫应答的蛋白多肽。对于细胞因子的检测方法主要有三种：细胞生物学检测、免疫学检测和分子生物学检测。细胞因子的发现依赖于其生物学活性，因此，建立了生物分析法用于细胞因子的检测。随后，用于检测实验溶液(如组织培养上清液)中细胞因子的免疫分析法被建立，并不断用于实验室研究。但准确地、可重复地测定细胞因子具有一定困难，主要原因是众所周知的细胞因子的含量极低(大部分都是以pmol/L计)，同时存在着源于异嗜性抗体，类风湿因子以及特异的和非特异的细胞因子结合蛋白等[1，2] 的显着干扰。

10. 已经冻存的动物组织还可以做冷冻切片吗

已经冻存的动物组织不可以做冷冻切片。

防止组织中形成冰晶而影响细胞的形态，甚至破坏细胞的结构，在组织冰冻时要采用速冻的方法。组织块在冰冻时，应根据组织的形状和结构来放，切片也是如此。

冷冻切片：

1.切片前先安装好刀片，调整好切片厚度及切片角度。根据标本的组织类型，确定最佳切片温度。

2.将待切的组织块平放在软塑瓶盖或特质小盆内，直接或涂敷包埋剂后马上放到冷冻台上冷冻。

3.将冻好的组织块安装到组织块夹持器上，调整好刀片与组织块之间的角度和距离，调整好防卷板的位置和角度。