A. Western blot实验需要准备什么试剂和耗材
试剂：tris、Hcl、Nacl、脱脂牛奶、甲醇、甘氨酸、tuwen20、一抗、二抗、显色剂及SDS-PAGE需要的试剂（tris、Hcl、TEMED、SDS、过硫酸铵、丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、非预染蛋白Marker、甲醇、乙酸、考马斯亮蓝R250）、预染蛋白Marker
耗材：滤纸、PVDF膜或NC膜、乳胶手套等
仪器：电泳仪、电转槽、摇床、制冰机（电转时需冰浴）等
B. 动物取材做pcr和wb需要切多大
最低的是6
在大量的文献中可以看到动物行为学往往要求n=8以上，在高质量的文献中可见n在20以上，在条件有限的限制下，最低的n的为6
动物实验结束后，对实验对象进行病理解剖和取材，以便进行后续的检测实验。常规下一般取下实验对象的脏器、皮肤、脑、具有代表性的病灶及周围组等常规取材样本：心脏、肝脏、脾脏、胃、肺脏、肾脏、大肠、小肠、结肠、淋巴结、肾上腺、胸腺、胰腺、子宫、血管、神经等。脑部取材：大脑、小脑、海马、皮层、下丘脑、垂体等。
C. 由于第一次做western blot ，想请教一个问题，在做WB之前要对培养细胞中的蛋白质进行提取，也就是用裂解
上清液检测的分泌蛋白 用的是ELISA检测 细胞裂解液检测的是胞内蛋白含量。。。。
D. 组织研碎后Trizol一般裂解多长时间
trizol说明书里好像不是很详细，用起来效果也一般。还是往圣的typhon好用，说明书也很详细。
RNA的提取
准备试剂
氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。
操作步骤
1．匀浆处理
a、组织:将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml Typhon；肝脏、脑等柔软组织用匀浆仪进行匀浆处理。然后加入1mlTyphon，反复轻柔吹打，直至溶液不抽丝，样品体积不应超过Typhon体积10%。
b、单层培养细胞:去除细胞培养基，PBS冲洗一次，直接在培养板中加入Typhon裂解细胞，每250px2面积加1ml，用移液器吸打几次，转移至1.5ml离心管，反复吹打，直至溶液不抽丝。Typhon的用量应根据培养板面积而定。Typhon加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c、细胞悬液:离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml Typhon，反复吸打直至溶液不抽丝。加Typhon之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃ 12000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除，取澄清的匀浆液进行下一步操作。
4．第一步每使用1ml Typhon加入0.2ml氯仿，轻柔振荡或吹吸15秒，室温放置3分钟。
5．2-8℃ 12000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色或淡黄色水相，中间为固相。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Typhon试剂的60%。
6．把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml Typhon加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
7．2-8℃ 10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
8．用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml Typhon至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
9．室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10分钟。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS（本公司均有售），用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解。-70℃保存。
RNA的提取注意事项
1．从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800μl Typhon匀浆样品，离心取上清液后，异丙醇沉淀RNA前加5-10ug RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
2．匀浆后加入Typhon，加氯仿之前样品可在-60—-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8℃一个星期以上或-5—-20℃一年以上。
3．分层和RNA沉淀时也可使用低速台式离心机，2600×g离心30-60分钟。
RNA的提取常见问题分析
得率低：
A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B．RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65：
A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。
B.样品匀浆时加的试剂量太少。
C.匀浆样品时未在室温放置5分钟。
D.吸取水相时混了有机相。
E.RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：
A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.细胞在胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染:
A.样品匀浆时加的试剂量太少
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
蛋白聚糖和多糖污染:
沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1mlTyphon在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，加入以上操作步骤。
DNA的分离
准备试剂
乙醇、0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇)、75%乙醇、8mM NaOH
操作步骤
1．样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTyphon加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g离心5分钟。
2．移去上清，（如需要分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTyphon加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。
3．用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每使用1mlTyphon加入1.5-2ml75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃2000×g离心5分钟,弃上清。
4．室温放置晾干DNA5-15分钟，用8mMNaOH溶解DNA。从50-70mg组织或10细胞中分离的DNA溶于300-600μl8mMNaOH，DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE、HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物，可>12000×g离心10分钟除去。
DNA的定量
取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。理论上，人、大鼠、小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量约分别为7.1μg,6.5μg,5.8μg。
分离DNA的应用
1．用于PCR 溶于8mMNaOH的DNA用0.1MHEPES调pH至8.4,取0.1-1μgDNA用作PCR模板。
2．酶切反应 用HEPES或1mMEDTA调节pH至适当值。每μgDNA使用3-5单位的酶,酶用量为3-5 IV/mgDNA。
DNA分离注意事项
1．DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜。
2．DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存数月。
3．DNA在8mMNaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM可置于4℃或-20℃长期保存。
DNA的分离常见问题分析
得率低
A.样品匀浆和裂解的不彻底
B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解
A260/A280<1.70
A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中
B.酚除去不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。
DNA降解
A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪
RNA污染
A.氯仿分层后水相未完全去除
B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗脱不彻底
蛋白质的分离
准备试剂
异丙醇、含0.3M盐酸胍的95%乙醇、无水乙醇、1%SDS
操作步骤
1．取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1mlTyphon加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。
2．用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTyphon加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2-8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3．真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃水浴使其完全溶解，不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Westernblot或-5--20℃保存备用。
蛋白质的提取注意事项
1．蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5--20℃一年以上。
2．用0.1%SDS在2-8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western blot。
蛋白质的提取常见问题分析
得率低：
A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解
蛋白质降解：
组织取出后没有马上处理或冷冻
电泳时条带变形：
蛋白质沉淀洗涤不充分
E. 如何从动物组织中裂解得到蛋白
将组织用液氮研磨碎了，然后按量加入裂解液，细胞量在10七次方左右是100微升。冰浴裂解20分钟（间断摇动）。然后4摄氏度离心12000rpm，15分钟。吸取上清定量。根据测定量的结果将各样品总蛋白量调匀，然后等体积加入loading buffer就可以电泳了。
因为你最后取得是蛋白量，所以保证最终的总蛋白是相同的量就好了，组织只是提取的介质，我们定量的是最终的蛋白，而并非组织样品的蛋白含量。如果你想区分两种不同组织的蛋白含量是不同的，才会用到相同组织量。
在普通陶瓷研钵中就能进行，而且研钵可以不一次性使用。研钵处理的时候需要用锡纸包裹好，通过干热法灭菌，120℃烘箱。当然之前要洗干净。